传染性蛋白的“负面”和“正面”（2）

朱钦士 （美国南加州大学医学院）

（上接2018年第4 期第24 页）

1.3 蛋白质分子中肽链的折叠机制 蛋白质是生命活动的执行者，除了催化细胞内数千种化学反应外，蛋白质还在细胞和机体结构、生物防卫、信息传递等方面起不可或缺的作用。这里说的“信息传递”，不是传递蛋白分子自身的信息，而是细胞外部和内部的信息，例如细胞表面的受体就是由蛋白质组成的，它们接收各种外部信息，包括光信号、机械振动、温度、压力、酸碱度、渗透压，以及调节细胞生长分化的信号等，再传输到细胞内部。

不同的生理功能不仅需要不同的蛋白质，还需要蛋白质分子形成各自的结构和形状。形成不同结构和形状的生物大分子理论上可以走2 条路线：一种是分支的，像灌木的树枝；另一种是不分支的，即线性的，像毛线绕成线团。前者在每个分支处都需要专门的酶，使得生物大分子的合成和分解较为困难，所以只限于支链淀粉和多糖这样相对简单的分子。不分支的生物大分子只需要一种酶，即可完成将组成单位合成为大分子，或将大分子分解为组成单位的过程，效率很高。核酸（DNA 和RNA）和蛋白质这样的生物大分子都是线性的。但线性的蛋白质分子也带来一个问题，它像一根细长的绳子。是什么机制让其“绕”成不同的形状？

蛋白质是由20 种氨基酸线性相连组成的分子。每个氨基酸分子内有一个“中心碳原子”，称为α-碳原子。这个碳原子发出4 根化学键，平均伸向空间，与其他原子相连。要直观地了解这4 根化学键的方向，可以想象一个四面体，即金字塔的形状，与碳原子相连的4 个原子分别位于四面体的4 个顶角上，碳原子则位于四面体的中心，它与4 个原子连线的方向就是碳原子4 根化学键的方向。这样，每2 根键之间的夹角都是109.5 度，所以任意2 根化学键都不在一条直线上。

这4 根化学键中，一根连上一个氨基（-NH2），一根连上一个羧基（-COOH，其中的2 个氧原子都与碳原子相连，其中一个氧原子还与一个氢原子相连），第3 根连上一个功能基团，第4 根连上一个氢原子。一个氨基酸分子上的氨基和另一个氨基酸分子上的羧基可彼此反应，脱掉一个水分子而连到一起，形成“肽键”（peptide bond，-CONH-，其中的氧原子只与碳原子相连，氢原子只与氮原子相连）。多个氨基酸分子这样线性相连，就形成“肽链”（peptide）。第3 条化学键所连的功能基团不参与肽链的形成，朝向一侧伸出，像长绳子上横向伸出的短绳子，成为“侧链”。肽链卷曲成为最后功能状态的形状，就是通常所说的 “蛋白质”（protein）。

在分子中，以单键相连的2 个原子是可以彼此转动的，就像被一根牙签穿在两头的2 个塑料球；而以双键相连的2 个原子则不能相对转动，就像2 个塑料球被2 根牙签穿在一起。肽键中的碳-氮键，看似单键，其实由于氮原子上的一对“未共用电子”和碳-氧双键中的π 电子部分重叠，所以这个碳-氮键具有部分双键性质，是不能转动的；肽键中的4 个原子也都位于同一个平面上，相对位置无法改变，像一个刚性的“片”。而α-碳原子与羧基中的碳原子之间的化学键，以及α-碳原子与氨基中的氮原子之间的化学键，是“真正”的单键，所以与α-碳原子相连的羧基碳原子和氨基氮原子是可以转动的，并且带着与它们相连的分子部分一起转动。再加上这2 条化学键不在一条直线上，使得肽链的形状得以改变。这是肽链能够改变形状的原因，也使得线性的蛋白质分子“卷”成特定的三维结构成为可能。在生物化学中，“卷”的专业名词是“折叠”（fold）。

肽链改变形状的机制清楚了，现在的问题是，肽链是怎样折叠成具有一定三维结构的分子的？这是一个非常复杂的过程，因为牵涉的力作用点数量太多，就连目前世界上功能最强大的计算机都无法加以模拟，但是可以形象地加以描述。肽链折叠的过程，总的来说就是分子内的电荷彼此相互作用，包括肽键上的电荷和侧链上的电荷，以及这些电荷与环境中分子相互作用的结果。

肽键上的氧原子和氮原子都是“电负性”（获取电子的能力）比较强的原子，能从与它们相连（即共享电子）的原子上多得一些电子，因此带部分负电，所以在肽键（-CO-NH-）中，氧原子和氮原子都带部分负电，而与氮原子相连的氢原子则带部分正电。这样，一个肽键上的氧原子就可以与同一条肽链中的另一个肽键上的氢原子彼此通过电荷相互吸引，形成“氢键”（hydrogen bond）。氢键不是共价键，但却是分子之间或分子内不同部分相互作用的重要力量。

一条肽链含有许多肽键，但不是任何2 个肽链之间都可形成氢键。α-碳原子上的化学键也不是可以任意角度旋转，带有侧链的氨基酸会在一些角度构成空间障碍，这样相邻或相距太近的肽键之间就无法形成氢键。在肽键之间“舒服地”形成比较稳定的氢键主要有2 种方式。一种是肽链卷成右旋的螺旋状，每个肽键上的氧原子和相隔2 个（即第3 位）的肽键上的氢原子形成氢键。这样每3.6 个氨基酸单位绕一圈，形成所谓的“α-螺旋”（α-helix）。这个螺旋总体看就像一根“圆棍”，侧链从圆棍上伸出，好像树干每3.6 圈长出一片树叶。α-螺旋是蛋白质分子中最重要的基本结构之一，它上面伸出的侧链的性质决了这段螺旋的亲水性和亲脂性，例如蛋白分子穿越细胞膜就是通过亲脂的α-螺旋实现的。

另一种在肽键之间形成氢键的方式不是肽链卷成螺旋状，而是肽链中的一些片段伸直，在这些伸直的片段之间的肽链则弯曲，将这些伸直的片段平行地排列在一起（想象一根绳子在地板上来回弯曲，形成多条平行的伸直部分）。肽链像曲别针那样直接拐弯回来，形成的2 根伸直的肽链片段方向是相反的，但是相邻的肽链片段也可以是同方向的，这就需要中间的肽链部分不是简单地折回来，而是要在空中“绕一圈”。这样，一根伸直肽链片段上的肽键就可以与相邻的、 同样是伸直的肽链片段上的肽键形成氢键。多条这样彼此以氢键相连的伸展肽链节段就会形成一个大致的平面，就像几根筷子排在一起可以构成一个平面。说是“大致”，是因为碳原子发出的4 根化学键不在一个平面上，肽链上的原子不可能都在一个平面上，所以肽链不可能完全伸直，而是有“皱褶”。多个伸直的肽链片段也不一定都在一个平面上，而是可以彼此之间方向有小的转动，形成扭转的平面； 也可以两边的肽链片段抬高，形成卷曲的平面。这样形成的结构叫做“β-折叠”（β-sheet），是蛋白质分子中另一个重要的基本结构。简单来说，就是α－螺旋像“棍”，而β-折叠像“片”。

还有一些肽链部分既不在α-螺旋中，也不在β-折叠中，肽键的结构常常是无定形的。所以蛋白质分子中肽链的形状可分为3 类：①在α-螺旋中的；②在β-折叠中的；③不在以上2 种结构中的。这3 种结构有自各的空间排布形式，在不同方向上的光学性质也不一样，对左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的吸收程度不同，称为“圆二色性”（circular dichroism，CD）。通过测定蛋白物质的圆二色性，即可知道其中α-螺旋和β-折叠的含量。

除了肽键，许多侧链也是带电的，例如谷氨酸和天冬氨酸的侧链因为有羧基，所以带负电；赖氨酸、 精氨酸和组氨酸的侧链上还有氮原子，带正电。丝氨酸的侧链上有羟基（-OH），半胱氨酸的侧链上有巯基（-SH），其上的氢原子都带一些正电。这些电荷也会彼此作用，以及与肽键上的电荷相互作用，影响肽链最后形成的形状。

除了分子内电荷的相互作用，蛋白质分子是溶在水中的，而水分子是带电的分子，其中的氧原子带部分负电，2 个氢原子带部分正电。不仅水分子之间可以形成氢键（这也是水的沸点如此之高的原因），水分子和蛋白质中带电的部分也会形成氢键；水中溶解的带电离子，包括钾、钠等正离子和氯、碳酸根等负离子，也会与蛋白质分子上的电荷相互作用，从而影响肽链的折叠过程。

有些氨基酸的侧链是不带电的，例如丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的侧链完全由碳原子和氢原子组成，无论是碳原子还是氢原子都不带电。这些侧链无法与水分子之间形成氢键，若突进水分子之间又会破坏水分子之间的氢键，在能量上是不利的，所以这些“憎水”的侧链往往被水环境排斥，位于分子的内部，以避开与水分子的接触，形成蛋白质分子的“油性内核”。

所有这些相互作用都会影响肽链的折叠，所以蛋白质分子的折叠是一个极为复杂的过程，肽链可以采取的形状的数量也是天文数字。如果蛋白质分子随机地尝试所有这些形状，即使有亿万年的时间也不够，但是在细胞内，肽链在合成后不到1 s 的时间就完成折叠过程，这又是如何实现的？

简单来说，就是遵循最低能量法则，即将肽链折叠到能量最低、也最稳定的形状。肽链在伸展状态时，许多氢键都没有形成，相当于储存了许多“势能”，就像位于高处的石头，很容易向较低的地方滚动。氢键的形成逐步释放出这些能量，相当于石头逐渐滚下山坡，最后到达位置最低处。在蛋白的氨基酸序列里就包含有信息，折叠从一些局部开始，最后扩展到整个分子。

由于折叠过程的复杂性，走向能量较低状态的路径也许不只一条，相当于山顶上的石头可从不同的路径滚下山坡，而且还有比较低、但不是最低的地方“等着”它，所以石头不一定能够到达最低的地方。

环境条件的变化，例如温度、酸碱度、盐浓度、其他分子的存在状况等，都可能影响蛋白的折叠过程。许多肽链在合成尚未完成时就开始折叠，由于缺乏整体的信息，由部分肽链折叠成的形状也许是不正确的。

基因突变也可能影响蛋白的折叠。如果基因突变改变了蛋白质分子中与折叠有重要关系的一个或多个氨基酸，就会使蛋白寻求另一种最低能量状态，即不能再折叠成正常蛋白的形状了。最著名的例子是镰刀形红血球贫血症（Sickle-cell anaemia，SCA）。患者血红蛋白β-亚基的基因中发生了突变，一个碱基从A 变成了T，使得第6 位的谷氨酸残基（由GAG 编码）被缬氨酸残基（由GTG 编码）取代。由于谷氨酸残基的侧链是带负电的，而缬氨酸残基的侧链不带电，这一个电荷的变化就影响了蛋白质分子中电荷相互作用的情形，使得变异的蛋白质形状改变，红血球也从碟形变为镰刀形，且不能有效地输送氧气。

蛋白在细胞中浓度过高也会引起折叠变化。许多功能蛋白复合物含有多个蛋白亚基，这就要求每个亚基在细胞中生产的数量必须彼此匹配。如果某个亚基生产过多，这个亚基“找不到”复合物中其他的亚基，只能自己单独存在，而这种状态是不稳定的，也会导致异常的折叠状况。

抗体分子由重链和轻链2 种蛋白质组成。为了对数量巨大的外来物质产生结合力，抗体蛋白的可变部分（即用于结合外来物质的部分）是由DNA 小片段随机组合而成的序列编码的。这种机制能从有限数量的DNA 片段产生数量极为巨大的DNA 序列，是生物的“聪明”之处，但是这种机制也有问题，即有时产生的重链和轻链非常容易转变为Prion 型的结构。

即使蛋白分子折叠成为正确的形状，也是容易改变的。氢键的键能一般不超出10 kcal/mol，远低于共价键的每摩尔近百到几百千卡，而和室温下分子的动能在一个级别上，因此温度升高会使氢键破裂，即氢键会因周围分子的碰撞而被“撞断”，因此随着温度的升高，蛋白质的稳定性也降低。鸡蛋被煮后蛋清凝固变白就是高温使蛋白中的氢键破裂，肽链伸开互相缠绕的缘故，这个过程称为蛋白质的“变性”（denaturation）。

由于这些原因，新合成的肽链中，平均有约30%不能折叠成为正确的形状，已折叠好的蛋白质分子也有可能变性。为应付这种情况，细胞发展出了多种机制以减少和清除折叠错误的蛋白。

一种机制是细胞发展出的“伴侣蛋白”（chaperones），它们结合在尚未完成的肽链上，防止蛋白质分子过早折叠，并帮助蛋白质分子折叠成为正确的形状。这些蛋白也能减少温度升高时蛋白质的变性，在细胞遇到热冲击时会增加这些伴侣蛋白的量，所以这些蛋白又称为“热休克蛋白”（heat-shock protein，hsp），例如hsp70，hsp90、hsp104 等，其中的数字表示这些蛋白的分子量（kDa，即千道尔顿）。

若蛋白分子已经折叠错误并不可挽回时，唯一的办法就是清除它们。细胞质内是不能有降解蛋白分子的蛋白酶的，不然正常的蛋白分子也会被降解。细胞采取的办法是将这些异常蛋白质在蛋白体（proteosome）中降解，或者在细胞中的“胃”——溶酶体（lysosome）中降解。

蛋白体是由多个蛋白亚基组成的圆筒形结构，中段的内面有蛋白酶活性，可将进入筒内的蛋白质（以伸展开的肽链的形式）水解为氨基酸。由于蛋白酶的活性位于圆筒内面，对圆筒外的蛋白质不会有影响。为了只让要被清除的蛋白进入蛋白体，细胞将需销毁的蛋白分子都打上“标签”，这个“标签”也是一种蛋白质分子，由于在各个细胞中广泛存在，称为“泛素”（ubiquitin）。只有被泛素标记的蛋白质才能被蛋白体识别并让其进入。

折叠错误的蛋白常彼此结合，聚合成为较大的“团块”或成纤维状。这些聚集的蛋白即使被打上“泛素”的标签，也由于其体积太大而使蛋白体“啃”不动它们。这时细胞就会启动另一种功能，即“自噬”（autophagy），细胞质内形成半球形的膜，像张开的“嘴”，将一部分细胞内容物，包括蛋白凝聚物，甚至一些细胞器如线粒体，都“吞”进去，形成完全由膜包裹的“自噬体”（autophagosome），自噬体和溶酶体融合，自噬体中的内容物就进入溶酶体，在那里被消化。

若折叠异常的蛋白在细胞外凝聚，细胞就不易将其清除。疯牛病的Prion 蛋白和引起老年痴呆症的Aβ 蛋白（见后文）都是在神经细胞外形成聚合物和斑块的，细胞不能有效地清除它们，最后导致细胞的死亡。即使是在细胞内，在有些情况下，细胞也无法清除它们。因此，即使细胞有多种机制用于防止蛋白折叠异常和清除折叠异常的蛋白质，在有些情况下，折叠异常的蛋白质还是会出现，并在细胞外或细胞内留存、积累，从而导致疾病。

1.4 传染性蛋白的结构特点和传染性的由来蛋白分子发生异常折叠后，分子的结构会发生改变，其中最重要的是原来的α-螺旋和无定形的肽链部分转变为β-折叠。例如“正常”的Prion 蛋白（PrPc）中含有大约40%的α-螺旋，而几乎没有β-折叠。而在引起痒羊病的Prion 蛋白（PrPsc）中，却有45%的肽链部分在β-折叠中。

不仅如此，PrPsc中的β-折叠还会作为模板，“诱使”PrPc蛋白也形成同样的β-折叠，即变成PrPsc的分子结构。换句话说，PrPsc蛋白有以自身为模板，以PrPc为原料，“复制”自己的能力。这正是这种形式的蛋白质具有传染性的原因。即使到了新的动物体内，它也能将该动物的PrPc改变成为PrPsc，即在新的动物中复制自己。

如果PrPsc复制自己后仍停留在单分子状态，则没有毒性，最多使得PrPc的数量减少，相当于使PrPc的功能减弱或消失。但是PrPsc分子并不停留在这一步，而是多个PrPsc分子还会通过β-折叠一层层地叠加，形成细长的纤维状结构，称为“小纤维”（fibril）。这样的结构就可以具有毒性，导致神经细胞的坏死。用聚合程度不同的PrPsc聚合物感染豚鼠的大脑，发现含有14~28 个PrPsc分子的小纤维，即聚合程度尚不高的小纤维，毒性最强，但其杀死神经细胞的机制尚不清楚。

用电镜观察这些小纤维，发现其直径在10 nm左右，不分支。新的PrPsc分子加在小纤维的顶端，使小纤维不断延长，因此观察到的小纤维长度不一。在小纤维中，β-折叠中肽链的方向是与纤维的长轴相互垂直的，称为“横向”的β-折叠（cross β-sheet），即小纤维是由β-折叠的“片”一层层地叠加而成的，就像盘子可以叠起来，形成一大摞盘子一样。这样形成的结构极为稳定，不易被蛋白酶水解，且能耐受高温处理。这是食用受疯牛病感染的牛肉，即使经过充分的烹煮或烧烤，也会被传染上疾病的原因。

这样的结构可用染料“刚果红”（Congo Red）染成砖红色。在结合到Prion 型的肽链结构时，刚果红在可见光范围内的吸收峰会向波长更长的方向移动，从刚果红自身的480 nm 变为长于500 nm。此性质可用于鉴定Prion 型的蛋白结构。由于小纤维中β-折叠具有方向性，对偏振光的吸收率随方向而不同，被刚果红染过的PrPsc蛋白在偏振光显微镜中呈苹果绿色，称为“双折射”（birefringence）现象，这是鉴定传染性蛋白的另一个特征性指标。还有一种染色办法是用硫黄素T （Thioflavin T，ThT）。它在结合到传染性蛋白上后荧光强度会增加，且发出的荧光峰值有红移现象，即发射光谱的波长变长，从445 nm 移到482 nm，由此可作为另一个鉴定Prion 型蛋白的指标。

同样是β-折叠，为什么多数蛋白的β-折叠并不引起蛋白分子聚集为小纤维，也不引起疾病，而传染性蛋白却能通过它们的β-折叠聚合成小纤维，引起疾病？ 2017年，德国科学家用冷冻电镜成像技术（cryo-electron microscopy）测定了引起老年痴呆症的Aβ 纤维的详细结构，找到了问题的答案。在“正常”的蛋白分子中，β-折叠的“片”通常被α－螺旋的“棍”隔开，彼此不能接触，所以“正常”的蛋白分子中没有β－折叠的“片”叠加在一起的情形。这些β-折叠的“片”通过它们氨基酸残基的侧链与肽链的其他部分，以及溶液中的分子彼此相互作用，保持蛋白分子大致球形的形状。在这样的蛋白分子中，亲脂的侧链位于分子内部，不与外界的水接触，亲水的侧链则位于分子表面，与水“亲密接触”，形成内部是“油性”，外部是“水性”的分子结构，即所谓的“油滴”模型。而在传染性蛋白中，β-折叠“片”的中心部分是亲脂的，即这些部分的许多氨基酸残基的侧链是不带电的，而“片”的周围是亲水的，形成的不是“中心油滴”，而是“中心油片”。由于片内油性的中心不像“油滴”分子那样是被亲水的外部完全包裹、彼此隔绝的，而只是在平面的周围被亲水部分围绕，在上、下两面仍然是暴露于水溶液的。这是一种不稳定的状态，再加之这样的“中心油片”之间没有α－螺旋“棍”的阻挡，所以这样的“片”能叠在一起，中心部分通过它们亲脂的侧链相互作用，周围部分通过亲水的侧链相作用，导致“片”的叠加，形成不分支的小纤维。这些小纤维的中心部分是亲脂的，周围则是亲水的，所以不是被亲水部分包裹的“油滴”，而是被亲水部分包裹的“油棍”。这是比较稳定的结构。与“油滴”结构是彼此独立的情形不同，这种“片”的叠加是没有终点的，每个肽链形成的“片”都可无限制地叠加在已形成的小纤维末端，形成越来越长的纤维。

这样的结构有些像DNA 的双螺旋，亲脂的碱基在内部，彼此叠加在一起，亲水的磷酸-核糖键在外部。Aβ 蛋白形成的小纤维甚至也是“双螺旋”，每一层由2 条Aβ 肽链组成，它们各自形成的一个β-折叠“片”，2 片通过离子键对在一起，成为小纤维中的一层，且整条纤维也呈一定的螺旋结构，但不是α－螺旋，而是更大尺度上的螺旋。

许多蛋白质都含有容易变为β-折叠的肽链部分，若将这些部分从分子中游离出来（例如引起老年痴呆症的Aβ 片段从它的前体蛋白APP中游离出来，见后文），除去那些可形成α－螺旋的肽链部分，且这样形成的β-折叠片是“中间油性周围水性”的，就可以形成β-折叠片叠加的情形。基因突变也可以改变蛋白分子的折叠方式，在不删除肽链其余部分的情况下，也可以形成可叠加的β-折叠片。这样形成的小纤维由同样的基本原理形成，但具体结构却随肽链的不同而异，沉积的位置不同，引起的疾病也不相同，导致一大类蛋白分子因“折叠错误”而引起的疾病，因其都与传染性蛋白形成“淀粉样”的沉积有关，故统称为“淀粉样变性病”。这将在本文的第2 部分中加以介绍。

（待续）