鼠痘病毒感染机制及其检测方法研究进展

周 洁, 赵丽娟, 陶凌云, 胡建华, 高 诚

(上海实验动物研究中心, 上海 201203)

鼠痘病毒(ectromelia virus，ECTV)属于痘病毒科正痘病毒属，是引起小鼠鼠痘(ECT)病原体。1930年英国的Marchal在实验鼠群中最早发现了患该病的小鼠足部缺失的特征明显, 她将这种病称为传染性脱脚病(infectious ectromelia), 1947年Fenner将本病命名为鼠痘[1]。ECTV粒子呈砖形或卵圆形，大小为230 nm×170 nm, 由1个核心、2个侧体和2层脂质外膜组成, 是动物病毒中体积大、结构最复杂的DNA病毒。该病毒基因组为双股DNA，长度180～200 kb, 编码200多种蛋白，基因组具有较长的约5 kb端重复序列(TTRS)，这一结构可能与病毒繁殖方式有关[2]。ECT的临床症状分为三种:急性感染的小鼠很快死亡; 慢性感染的小鼠最早出现的可见病变位置通常在面部、鼻、足或腹部，均伴有溃疡性病灶，病鼠散在性连续性死亡，剖检死亡小鼠可见肝脏、肾脏的出血性坏死; 脾脏肿大;淋巴结变大并时常伴有小肠出血。潜伏感染的小鼠不表现临床症状, 潜在的病毒可在应激条件下爆发。目前ECTV广泛存在于世界各国，严重影响实验小鼠的繁育生产、动物实验的顺利进行以及科研数据的准确性和可重复性[3]。本文侧重于对ECTV感染机制、免疫应答及诊断等方面进行阐述。

1 ECTV的遗传抗性

早期研究[4]表明，ECT的抗病性取决于感染途径、感染病毒的毒性和小鼠的基因型。近交系小鼠分为对ECTV感染抗病型和ECTV易感型。易感品系如BALB/c、A和DBA/2，不能控制病毒的复制和传播，因而常发生不可控的肝坏死而最终死亡。另一方面，具有遗传抗性的小鼠品系，如AKR、C57BL/6(B6)以及某些129品系小鼠的致病性和致死率较低。Orlowski等[5]研究认为树突状细胞(DCs)是将先天免疫系统与适应性免疫应答相连的效应细胞， BALB/c小鼠感染ECTV后病毒消除DCs以防止宿主反应，诱导免疫抑制并维持慢性感染有助于病毒的传播。Dolega等[6]研究了BALB/c和C57BL/6小鼠感染ECTV-Mos后腹膜巨噬细胞中先天免疫基因的转录反应，揭示了基因表达的差异可能决定了BALB/c和C57BL/6小鼠对ECTV-Mos的致死感染的抵抗/易感性的差异。Cheng等[7]分别取感染ECTV后3～10 d的BALB/c和C57BL/6小鼠脾脏做基因芯片，分析二者的基因差异表达，结果显示易感型BALB/c小鼠相对产生更多的差异表达基因，这些基因参与先天免疫、细胞凋亡、代谢和癌症相关的通路，而C57BL/6抗病小鼠差异表达基因主要参与促分裂原活化蛋白激酶信号和白细胞跨内皮迁移。

在ECT小鼠模型中, 普遍观点认为近交系小鼠的遗传抗性是由多种不相关联的常染色体显性基因控制。位于6号染色体上的鼠痘抗性基因1(Rmp-1)控制病毒在肝脏中的复制, 与自然杀伤细胞基因复合体(NKC)相关。鼠痘抗性基因2(Rmp-2)位点在2号染色体上，与补体C5基因相关。ECTV感染时，其对雌性小鼠的保护要强于雄性小鼠。C5基因缺陷小鼠，如DBA/2小鼠，感染时感染部位产生白细胞增多现象。而鼠痘抗性基因3(Rmp-3)连接在主要的组织相容性复合体(MHC)(H-2)上，通过CD8T细胞表达其功能，在感染后恢复中起到关键作用。鼠痘抗性基因4(Rmp-4)参与编码性腺依赖功能基因，与选择素基因复合体有关。ECTV天然抗病性机理在易感染品系感染后3 d开始出现临床症状，在感染期间细胞内serpinb9通过是维持成熟自然杀伤细胞和活化CD8T细胞与ECTV对抗[8-11]。

2 ECTV的免疫应答

免疫应答过程可以笼统分为固有免疫应答期和适应性免疫应答期两个阶段。在病毒入侵时，大多非特异性固有免疫应答在早期感染中被快速激发以保护宿主, 阻止感染进一步发生，同时等待特异性抗原应激缓慢的产生。ECTV的免疫和恢复很大程度上同时依赖于各种不同来源的固有免疫应激和适应性免疫应答，包括自然杀伤细胞、CD4和CD8 T淋巴白细胞、巨噬细胞、氮氧化合物、辅助性T细胞1型和α、β、γ-干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)的效应器功能[12]。有研究[13-15]表明, B 细胞和抗体在ECTV感染的控制和恢复中亦有关键性作用。

2.1 ECTV初期感染中抗体的作用

很长一段时期内，研究者对痘病毒的应激反应研究的重点都在T细胞效应器功能的作用上，而忽略了B细胞的功能。早期研究ECTV感染的B6小鼠得出的结论认为B细胞和抗体的作用或许来自T细胞的调亡[13]。单克隆抗体修饰的CD8(+)细胞亚型在ECTV感染的B6小鼠中的调亡抵消了细胞毒性T细胞(CTL)的应激反应，使小鼠不能清除病毒，因而大部分小鼠被ECTV感染后10 d死亡。另一方面，CD4T细胞的调亡导致非最佳条件的CTL应激反应，造成对病毒的控制和抵抗变得很弱。CD4T细胞的重要作用是帮助CTL的应激反应功能，因此，缺乏CD4T细胞会造成CTL抗病毒应激减弱。CTL的应激反应即使在感染的最后阶段仍能对病毒产生抵抗，但不足以清除病毒。类似反应也曾在缺乏MHC 2类分子的感染小鼠体内观察到，MHC 2类分子在感染后26 d仍能在主要器官呈现耐病毒能力，与缺乏CD8T细胞的感染后很快就死亡的动物不一样的是，这些小鼠在感染后12～14 d长出表皮点状溃疡。小鼠无论是CD4T缺乏还是MHC 2类分子缺乏，都不能产生中和抗体,因此这些动物缺乏CD4T淋巴细胞与B细胞相互作用的能力[12]。Reynolds 等[16]的研究认为, 多数痘病毒都表达一个约分子量200 000的膜蛋白同系物，在ECTV病毒中称作C15蛋白, 可调节感染ECTV小鼠的CD4+T和CD8+T细胞的免疫活性。将C15蛋白基因N-末端附近具有终止密码子的突变病毒注射到BALB/c小鼠足垫中, 死亡率比对照病毒组降低，免疫组织化学分析试验也证实在腹股沟淋巴结、脾脏和肝脏中突变体病毒数量较对照病毒少, 表明突变病毒扩散和复制减少。Szulc-Dąbrowska等[17]研究了ECTV感染对小鼠骨髓来源(GM-BM)细胞，包括常规树突状细胞和巨噬细胞的影响，结果表明ECTV能够在GM-BM细胞中复制并严重损害其先天适应性免疫功能，表现为细胞细胞的形态变化较大，在感染晚期细胞凋亡加剧。此外，细胞不能摄取、加工、处理抗原从而形成完全的炎症反应。因此，GM-BM细胞无法在原发性混合白细胞反应(MLR)中刺激异源性CD4+T细胞增殖。也就是说ECTV诱导GM-BM使其产生功能性免疫机制麻痹，从而影响其启动下游的T细胞的激活能力。

2.2 ECTV二级感染中抗体的作用

研究[18]表明缺乏胸苷激酶的无毒性ECTV病毒株的复制比野生型毒株效率低，能引起细胞修饰和抗体应激，但在感染后4周动物体内就无法再检测到病毒。而正常的易感近交系小鼠品系，例如BALB/c，如果一开始接种无毒性毒株，那在感染野生型ECTV后能引发大量针对ECTV的免疫应激反应并最终清除病毒。

MHC、CD40和μMT基因敲除(MHC II, CD40和μMT)的小鼠, 一般对野生型ECTV易感, 但感染无毒性ECTV毒株后可完全恢复。但是当这些小鼠经过二级野生ECTV感染时，就失去了产生大量中性抗体应激反应的能力，机体控制病毒的能力变弱从而易感甚至致死，与未进行无毒性毒株感染实验的动物类似。这表明B细胞的存在、CD4T细胞协同B细胞的相互作用以及后续抗体的产生, 是ECTV初期和二级感染中恢复的重要因素[17]。在痘病毒感染引起应激反应时, 一系列免疫因素, 包括CD4T和CD8T 淋巴细胞, IFN-α、IFN-β、IFN-γ和中性抗体都具有重要作用。不同的是, 二级感染的有效应激很大程度上取决于B细胞的应激和特异性病毒抗体[19]。在ECTV研究[20]中发现IFN在宿主应激反应中具有重要作用, ECTV作为一种小鼠易感病原体能和宿主共同进化, 它能编码IFN分泌型受体的同源染色体，这并不是ECTV的独有特征, 其它痘病毒也能编码和调整宿主IFN受体的信号表达途径。

3 病毒感染的致病机理

以往认为ECTV可以通过皮肤上的伤口或者污染物直接在动物之间传播，例如鼠笼的污染。研究[21]表明ECTV最常通过鼠足垫的传播而引起感染，病毒在动物感染部位表皮复制和释放病毒性传代物质直至传播至淋巴结、血液和其它器官。

当通过皮下途径感染时，ECTV在感染位点复制，然后扩散至淋巴结病毒继续复制。病毒侵入血液后引发一级病毒血症使病毒进入脾脏和肝脏，在这些部位坏死细胞释放更多病毒再进入血液引发二级病毒血症，二级病毒血症是导致皮肤出现点状溃疡的因素。这些溃疡与人类感染天花时的臁疮表现类似，其继续作为感染源在表皮感染，也是作为传播疾病的重要途径。小鼠易感品系的死因通常是由于肝坏死，常常出现在感染后8～10 d，与小鼠体内最高病毒滴度产生的时间相一致。

4 鼠痘的检测和防控

抗体检测方法有血凝抑制试验(HAI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验(IFA)和免疫酶试验(IEA)等。1980年代开展实验动物质量检测的初期, 国内普遍采用HAI方法, 该方法对为预防ECT而接种牛痘苗的小鼠血清不呈现阳性反应，但HAI法存在假阴性, 现已不采用。1990年代以后，IFA、IEA 和ELISA等开始应用于常规检测, 中华人民共和国国家标准实验动物ECTV检测方法“GB/T 14926.2001-20”规定了ECTV检测方法，其中有“GB/T 14926.2001-50 酶联免疫吸附试验、GB/T 14926.2001-51 免疫酶试验、GB/T 14926.2001-52 免疫荧光试验、GB/T 14926.2001-55 免疫组织化学法”。其中各检测机构普遍采用间接ELISA方法，IFA可以检出早期的抗体水平，也是目前较为常用的抗体检测方法。对ECTV抗原检测的传统方法是采用病理切片，显微镜下观察可见的典型痘病毒颗粒和痘病毒包涵体。另外, 把病毒分离接种于鸡胚绒毛尿囊腔传代后应产生融合性病灶，将其磨碎可产生特征性血球凝聚反应。潜伏感染的小鼠不易检出抗体, 通常建议采用免疫酶组织化学法(HI)或PCR方法进行检测。PCR技术检测ECT病毒在国内的报道首先出现于1998年[22], 可检出0.1 pg的ECT病毒基因。2016年Wang等[23]建立了一种基于原位杂交的量子点荧光检测方法, 使用biotin-dUTP替代dTTP，在聚合酶链反应期间将生物素掺入DNA探针中用于检测ECTV基因组DNA。

目前尚无治疗ECT有效方法，对于ECT,关键在于预防，而预防ECT最重要的是环境设施建设和管理的加强。建立严格的饲养管理和卫生防疫制度，SPF级环境设施的规范运行是目前控制ECT流行最有效途径。对于有ECT爆发的鼠群应采取全群淘汰原则，疑似病例的发现应及时上报并诊断以采取防控措施。ECT的爆发严重影响实验动物生产、干扰动物实验结果。无可见临床症状的潜伏期感染小鼠则是鼠群的一项巨大隐患，因此加强ECT病毒的检测必不可少。国外最新研究[24]表明，利用痘病毒种属间基因高同源性的特点，用多价天花病毒DNA疫苗免疫小鼠，再用缺失6个靶向基因的重组痘苗病毒进行加强免疫，可以保护小鼠免受150 LD50剂量的ECTV攻击。

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