淀粉脱支酶的制备和应用

根据对底物作用方式的不同，淀粉脱支酶主要分为普鲁兰酶和异淀粉酶。它们可以专一、高效地水解支链淀粉中的分支键，在工业中的应用非常广泛。在淀粉酶解过程中添加普鲁兰酶或异淀粉酶可以加快淀粉酶解反应的速度，缩短酶解时间，提高产品的转化率，降低其它酶制剂的使用量。目前，普鲁兰酶和异淀粉酶已经被广泛用于葡萄糖、麦芽糖、果糖、低聚糖、麦芽糊精等产品的生产。

研究者尝试采用重组技术来提高淀粉脱支酶的产量和性能。中国专利CN201610306855.6提供一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株，其对来源于Bacillus deramificans和Bacillus naganoensis的普鲁兰酶编码基因进行密码子优化，利用DNA Shuffling进行分子改组，得到一种嵌合体基因，嵌合体酶在酸性条件下能保持较高酶活，同时比酶活高于来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶。编码嵌合体的基因WXP03在巴斯德毕赤酵母细胞内表达出普鲁兰酶酶活，重组酶最适作用温度55℃，最适pH 4.5酶活半衰期约18小时，在55℃，pH 4.0酶活半衰期约为12小时。进一步诱变筛选获得一株摇瓶发酵酶活水平明显提高的巴斯德毕赤酵母突变株。突变株在5 L发酵罐上的发酵酶活达1 800 U/mL。CN201110459137.X涉及一种酸性耐热异淀粉酶基因工程菌及其应用。其采用化学合成获得异淀粉酶Tfu_1891编码基因序列，以pT7-7为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，在工业级发酵培养基中培养，经过诱导重组异淀粉酶发酵活力达到3 185 U/mL。该重组酶具有淀粉α-1，6葡萄糖苷键水解活性，最适温度为40～50℃，最适pH 5.5，在50℃下保温30 h，酶活仍保留50%以上。重组酶具有淀粉脱支活性，能水解淀粉中支链淀粉形成直链淀粉，该酶与α-环糊精葡萄糖基转移酶复配使用可以显著提高环糊精转化率，适合环糊精的工业生产。CN201610043739.X公开了一种普鲁兰酶突变体PulB-d99-D436H的制备方法及其应用，其获得方法是截取长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)普鲁兰酶的100-926氨基酸肽段，同时将其436位点的天冬氨酸Asp突变为组氨酸His，改造得到一个新的普鲁兰酶突变体。该突变体基因以同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)染色体中构建重组枯草芽孢杆菌，能稳定地发酵生产普鲁兰酶。该突变体酶能够提高淀粉和普鲁兰糖的水解效率。CN201210008693.X公开了一种来源于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌普鲁兰酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，该酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，该普鲁兰酶能水解淀粉中的α-1，6-糖苷键，不水解α-1，4-糖苷键，是一种I型普鲁兰酶，利用该基因生产的重组普鲁兰酶可以应用于淀粉加工中水解淀粉或者糊精中的α-1，6-糖苷键以提高淀粉的利用率。CN201610368731.0公开了一种异淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用。提供了淀粉水解酶系中关键酶之一的异淀粉酶基因，来源为corallococcus sp，该基因全长为2 436 bp，G+C含量为66%，编码811个氨基酸。利用该基因构建的工程菌株能高效表达异淀粉酶，该酶以土豆淀粉为测活底物，通过碘液检测异淀粉酶的活性，其比活力高达70 600 U/mg。CN201510281727.6涉及一种来源于sulfolobus tokodaii的耐高温异淀粉酶基因，将其克隆、表达在E.coli Rosetta中，该异淀粉酶耐高温、酶活力稳定，具有很强工业应用潜力；用于糖燃料电池时，可使淀粉类物质彻底水解为葡萄糖，从而提高能量转化效率，拓展生物燃料电池的应用范围。CN201210141970.4公开了一种生产重组混合异淀粉酶的方法。首先分别克隆解淀粉假单胞杆菌和软腐细菌的异淀粉酶基因；构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体，并将其表达载体转化毕赤酵母，筛选高表达以上所述的两种异淀粉酶的重组子作为工程菌；发酵毕赤酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶。该发明生产的重组混合异淀粉酶出现酶反应的两个最适温度和pH，理化特性高，适合于多种用途；由于实现两个酶基因同时在其毕赤酵母中表达，使其异淀粉酶产量显著提高，起到降低生产成本的作用。

随着新型淀粉加工产品及工艺的不断涌现，现代淀粉加工工业对淀粉脱支酶的性能要求不断提高。开发高催化活性、高特异性、高产率的系列淀粉脱支酶将成为淀粉脱支酶研究的新趋势。