鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC检测

钟运超,黄静静,张骞予,张 康

(广西壮族自治区梧州市人民医院/右江民族医学院附属梧州医院肿瘤科，广西梧州 543000)

鼻咽癌是东南亚最常见的头颈部恶性肿瘤，放射治疗是其主要的治疗手段。鼻咽癌在临床确诊时70%以上是中晚期。但中晚期的鼻咽癌5年生存率仍低。主要失败的原因是局部复发和远处转移。免疫治疗在降低复发和远处转移方面有独到的优势。目前，免疫治疗已成为恶性肿瘤新的治疗方法。而免疫治疗主要集中在免疫逃逸的研究。髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)可以通过多种机制介导肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤的发生、发展。因此MDSC是继调节性T细胞之后的另外一个备受关注的细胞，是一群缺乏淋巴细胞标志，未分化完全的骨髓源性异质性细胞群，是树突状细胞，巨噬细胞和(或)粒细胞前体。MDSC在人外周血的分子标志为HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+。MDSC在鼻咽癌领域研究较少。为进一步了解MDSC在鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC比例情况，本研究对45例鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC进行了检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 2014年1月至2015年7月在本院住院的45例鼻咽癌患者，其中男23例，女22例，年龄60～65岁(平均62.5岁)。均经病理组织确诊(鼻咽角化癌8例，鼻咽分化型非角化癌14例，未分化型非角化癌23例)。按照国际抗癌联盟2009年分期标准进行分期，其中Ⅱ期10例、Ⅲ期15例、Ⅳ期20例。全部病例均在放疗前均接受了2周的奈达铂联合5-FU(NF方案)的诱导化疗。全部病例均在第1次化疗前及第2周期诱导化结束后7 d抽取患者外周血，同时签署知情同意书，并获得本院伦理委员会批准。另外抽取20例健康志愿者的外周血作为健康对照组。所有研究对象既往无肿瘤和系统疾病病史，脏器功能基本正常，无伴有严重并发症等。

1.2流式细胞仪检测HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC的表达水平

1.2.1试剂与仪器 CD11b FITC(美国BD公司)，CD33PE(美国BD公司)，CD14 FITC(美国BD公司)，HLA-DR -APC(美国BD公司)，FACSTM Permeabilizing Solution2(10×)，购自美国BD公司，BD FACSTM lysing Solution(10×)，购自美国BD公司，PBS由博士德生物工程有限公司生产，台式离心机 Labofuge 400R Thermo Fisher产品；BD FACSCalibur 流式细胞仪(BECTON DICKNSON)，漩涡混均仪(VORTEX-GENIE)。

1.2.2检测方法 依据实验Panel为样本管编号，将待用抗体置于冰盒上备用。在试管中按Panel加入试剂规格要求的膜表面抗体；根据细胞计数结果加入适量的样本量；低速混匀3 s，室温孵育20 min；向每个试管中加入红细胞裂解液2 mL,混匀，在室温避光10 min；温育后立即在室温离心1 500 r/min，5 min；弃上清液，加2 mL PBS重悬，低速混匀3 s，室温离心1 500 r/min，5 min，倒掉上清液；加入1 mL破膜剂室温避光10 min，室温离心1 500 r/min，5 min,弃上清液；加2 mL PBS洗涤，低速混匀3 s，室温离心1 500 r/min，5 min，弃上清液；加入细胞内标记抗体，低速混匀3 s，室温孵育30 min；向试管中加2 mL PBS重悬，低速混匀3 s，室温离心1 000 r/min，5 min，倒掉上清液；最后加入0.5 mL含1%多聚甲醛PBS重悬，上机检测。

2 结 果

2.1鼻咽癌患者与健康对照组人群外周血MDSC的分布情况 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者外周血和健康对照组人群外周血均存在MDSC，分别是(0.89±0.22)%、(1.19±0.20)%、(1.58±0.39)%和(0.20±0.02)%，鼻咽癌患者外周血存在MDSC比例明显高于健康对照组人群(F=104.92,P<0.05)。而且随着Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分期的升高，鼻咽癌患者外周血MDSC比例也逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2不同病理类型的鼻咽癌患者外周血MDSC分布情况 本研究检测了鼻咽角化癌、鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3种不同病理类型患者外周血MDSC分布，结果显示：鼻咽角化癌、鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3种不同病理类型鼻咽癌患者外周血MDSC比例分别是(0.85±0.23)%、(1.21±0.20)%、(1.46±0.44)%，均高于对照组人群的比例(0.20±0.02)%(F=71.82，P<0.05)。3种不同病理类型的鼻咽癌患者外周血MDSC比例也有差异(P<0.05)，其中以未分化型非角化癌表达最高，达(1.46±0.44)%。

2.3NF方案诱导化疗前后鼻咽癌患者外周血MDSC分布比例 经过2个周期化疗后，各期患者外周血的MDSC比例均有显著降低，其中Ⅱ期化疗前(0.89±0.22)%、化疗后(0.41±0.24)%(F=5.89，P<0.05)，Ⅲ期化疗前(1.19±0.20)%、化疗后(0.53±0.21)%(F=9.65，P<0.05)，Ⅳ期化疗前(1.58±0.39)%、化疗后(0.99±0.31)%(F=7.72，P<0.05)。但其表达水平仍然高于健康对照组人群。

3 讨 论

鼻咽癌是东南亚最常见的头颈部恶性肿瘤，以广东、广西高发。放射治疗是其主要的治疗手段。但复发和转移仍然是鼻咽癌的主要死因。研究表明：肿瘤的发生、发展与机体免疫监视，免疫耐受，免疫逃逸和免疫无能等免疫紊乱有关。免疫耐受的持续存在，引起突变的细胞对宿主体内的免疫监视功能的无反应性，出现肿瘤逃逸，与其有关的主要是CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)细胞，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和髓源性抑制细胞(MDSC)等3种免疫抑制细胞。其中MDSC是一群髓源祖细胞中具有免疫抑制功能的细胞，健康人体内的含量很低，不会发生免疫抑制；但在烧伤，自身免疫疾病，急性或慢性感染等病理状态下，血清中MDSC比例会显著上升，进而发挥免疫抑制作用。而且是处于不同分化阶段对肿瘤具有免疫抑制作用的异质性细胞群。在人类细胞中分子标志主要表达CD11b+CD33+但缺乏CD14-和HLA-DR-[1]。在肿瘤微环境中MDSC可以诱导局部免疫耐受[2]，其免疫耐受不仅与肿瘤细胞本身因素如肿瘤抗原调变、MHC分子、共刺激分子表达降低有关，也与肿瘤引起的机体免疫功能异常关系密切。主要通过以下几种机制诱导肿瘤抗原特异性的细胞免疫耐受，包括释放转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素(IL)-10等细胞因子诱导调节T细胞(Treg)，Ⅱ型巨噬细胞的产生间接抑制T细胞增殖和活性；清除半胱氨酸可以抑制正常APC对T细胞的激活；通过产生活性氧，一氧化氮合成酶和精氨酸酶抑制T细胞增殖，促进T细胞凋亡；产生膜结合型TGF-β以直接方式抑制T细胞活性等[3]。另外MDSC还可以在肿瘤部位分化成调节性DC，后者引起的T细胞分泌IFN-r能力下降[4]。而抑制或杀伤肿瘤诱导的MDSC可以提高T细胞功能[5]。大量研究表明：鼻咽癌患者出现一系列免疫功能紊乱，造成机体对微生物及其毒素的反应发生异常改变，免疫异常对鼻咽癌细胞的种植、黏附、增生具有直接或间接作用，从而诱发鼻咽癌的不断发展与恶化。 鼻咽癌患者外周血的MDSC通过在数量上的增加等因素发挥免疫抑制效应[6]。研究报道在荷瘤小鼠和肿瘤患者的外周血中可以检测到MDSC细胞明显升高，并且具有很强的免疫抑制作用[7-8]。而健康者则不具有或仅有很弱的免疫抑制作用。 肿瘤患者外周血MDSC比例显著高于健康人群，其MDSC数量与肿瘤分期呈正相关[9]，其远处转移也与肿瘤患者外周血MDSC数量显著增加有关[10-11]，从而直接参与肿瘤免疫逃逸和远处转移。 本研究发现鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC比例明显高于健康对照人群的HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC比例(P<0.05)；随分期的上升而明显增多(P<0.05)，与文献[12]报道相似。可能因为肿瘤源性因子(TDFs)通过STATS信号途径促进MDSC的募集和扩增有关。提示这群细胞在鼻咽癌的发生、发展中起一定作用，可以用于判断病情，协助临床分期。进一步对鼻咽角化癌，鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3种类型的MDSC比例进行分析，发现鼻咽角化癌，鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3种类型患者外周血MDSC比例均高于健康对照组人群(P<0.05)。值得注意的是，在3种不同病理类型之间，其外周血MDSC比例也存在差异(P<0.05)，其中以未分化型非角化癌表达最高达(1.46±0.44)%。说明肿瘤分化程度越低，外周血中MDSC比例增高越明显。与文献[13-14]报道基本一致。提示其对判断患者预后具有一定意义。本研究也发现化疗在一定程度上能降低MDSC水平，两个周期NF方案化疗前后比较有显著差异(P<0.05)，但其结果仍然比健康对照组高。说明诱导化疗是能通过减少MDSC的比例，能部分恢复免疫功能。

综上所述，肿瘤患者免疫功能与肿瘤发生、发展，以及对患者预后的影响已经受到广大学者们的广泛关注，本研究对鼻咽癌不同期别、不同病理类型及诱导化疗前后鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC比例做了初步研究，发现鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC比例明显升高，提示可能与鼻咽癌免疫逃避有关，值得进一步研究。

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