微小RNA经Wnt通路调控成骨分化及其力学响应的研究进展

鄢志雄 综述，汪 洋，郭 勇 审校

(桂林医学院生物技术学院，广西桂林 541004)

微小RNA(miRNA)是一类长度约22 nt的内源性非编码RNA，主要通过识别靶基因mRNA和靶基因mRNA的非编码区碱基配对，引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译，在转录后水平负调控基因的表达[1]。miRNA在干细胞分化、增殖和新陈代谢中，起着关键调节作用[2]。Wnt信号通路是一个蛋白质相互作用的复杂网络，为生物生长发育所必需[3-4]。Wnt信号传导路径较多，据信号转导途径的不同，将Wnt信号通路分为经由β-catenin的经典Wnt/β-catenin信号通路、调控细胞平面极性的Wnt/PCP(planner cell polarity pathway)信号通路和调控细胞内钙信号的Wnt/Ca2+信号通路[3]。后两种被称为非经典Wnt信号通路。近年来，研究证明Wnt信号通路在干细胞的成骨分化和骨量维持上起着重要作用[4]。

力学载荷是控制骨重建的一个重要因素，适量的力学载荷能保持骨形态和功能的稳定[5]。有报道显示机械刺激能通过Wnt信号通路途径影响干细胞的成骨分化[6-7]。近年来大量研究都集中在机械应力刺激下干细胞成骨分化的分子机制方向[8-10]。然而，力学转导的确切机制尚未研究清楚。Wnt信号通路可能在机械刺激下的干细胞成骨分化信号传导过程中有重要地位，而与Wnt信号通路相关的miRNA也具有巨大的研究价值。本文就miRNA通过Wnt信号通路调控成骨分化的分子机制及力学载荷对此过程的影响方面的研究现状及新进展做一综述。

1 miRNA在干细胞成骨分化中的调控作用

干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，其成骨分化是众多基因程序性表达及精细调控的结果。miRNA作为一种转录后调控因子，它通过调节靶基因mRNA的表达，来调控分化过程中多种相关因子和受体，从而完成对干细胞成骨分化的精确调控。近年来大量研究表明，miRNAs对成骨分化上游信号(如骨形态发生蛋白，即bone morphogenetic protein，BMP)、成骨分化重要信号通路(如Wnt信号通路)及成骨分化下游标志性基因(如Runt相关转录因子2，Runx2)等都有调控作用[11-13]。

1.1miRNAs与成骨分化上游信号 转录因子Dlx在干细胞成骨分化中发挥重要作用。QADIR等[14]在研究中发现，BMP-2介导的成骨分化过程中，人和小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)中miR-124的表达与对照组相比约降低50%，而Dlx5、Dlx3和Dlx2的RNA和蛋白水平均数倍高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；另外，通过抑制miR-124的表达，结果表明Dlx基因的mRNA和蛋白的表达量均增加；且荧光素酶等相关报告基因分析表明，miR-124直接靶向Dlx3、Dlx5和Dlx2的3′-UTR。因此，miR-124通过作用于转录因子Dlx的3′-UTR，导致其mRNA的降解或翻译阻遏，抑制骨的形成。

1.2miRNA与成骨分化下游标志性基因 LI等[15]在研究小鼠BMSCs成骨分化时发现，在BMP-2诱导的成骨分化过程中，miR-2861通过抑制组蛋白脱乙酰基酶5(histone deacetylase5，HDAC5)的表达，抑制Runx2降解，从而促进骨形成。而在进一步实验中发现，原发性骨质疏松症患者体内premiR-2861纯合子发生突变，miR-2861表达量明显下调，且HDAC5表达异常升高；而小鼠BMSCs实验中，HDAC5表达增高的同时，Runx2表达降低，成骨分化作用受到抑制。因此，该研究结果提示miR-2861的异常表达作用于Runx2抑制成骨分化，并且与原发性骨质疏松症的发生关系密切。XU等[16]研究了人BMSCs成骨分化过程中的某些miRNAs的功能，通过验证发现其中miR-885-5p通过抑制Runx2及相关成骨基因的表达来调控成骨分化。

1.3miRNA经Wnt信号通路在成骨分化中的调控作用 Wnt信号通路分为经典Wnt/β-catenin信号通路和非经典Wnt信号通路。经典信号通路是由胞外的Wnt蛋白与膜上的相应受体蛋白，Frizzled家族蛋白(frizzled proteins，Fz)和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL receptor related protein，LRP)复合物结合，激活胞内的散乱蛋白(dishevelled，Dsh或Dvl)，诱导胞内的四聚体[APC蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、Axin支架蛋白、糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)、β-catenin]分解，使胞内β-catenin的降解途径无法进行，β-catenin浓度升高，进入核内与转录因子(TCF/LEF)结合，最终诱导成骨相关靶基因的表达，调控成骨分化[17]。非经典Wnt信号传导通路中，Wnt蛋白(主要包括Wnt5a、Wnt7a、Wnt11等)与Fz和LRP5/6结合引起相应非经典Wnt信号的激活[18]。miRNA对Wnt信号通路的调控分为3个部分：(1)miRNA可作用于细胞外和细胞内各种Wnt信号通路拮抗物[如Dickkopf相关蛋白(DKKs)、frizzled相关蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)等]的mRNA；(2)miRNA通过影响膜蛋白与受体结合及作用于四聚体(APC、Axin、GSK-3β、β-catenin)的各成分，影响胞内的四聚体的合成，调控成骨相关基因的表达。(3)miRNA还可通过非经典Wnt信号通路中的相关因子来调控成骨分化过程。

1.3.1miRNA与细胞外和细胞内的各种Wnt信号通路拮抗物 HASSAN等[19]研究人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)的成骨分化过程时发现，体外培养的hADSCs在成骨分化过程中内源性miR-218表达上调；增加外源性的miR-218促进其成骨分化，而下调miR-218的表达可抑制其成骨分化。经过对miR-218作用靶点的探究发现，miR-218直接作用靶点为SFRP2和DKK2(Wnt信号通路上游的抑制因子)，miR-218可解除SFRP2或DKK2对Wnt信号通路的抑制作用，从而激活Wnt/β-catenin信号通路；另外，模拟Wnt信号通路的激活或阻断Wnt信号通路，hADSCs内相应的miR-218的表达水平随之增加或减少。因此，该课题组推测miR-218与经典Wnt信号通路对干细胞成骨分化的调控是一种反馈调节过程。KAPINAS等[20]研究发现，高表达的miR-29a/c对Wnt/β-catenin信号通路的抑制因子DKK1(Wnt信号通路的上游抑制因子)产生直接抑制效应，使Wnt/β-catenin信号通路激活；另一方面，miR-29a/c又以骨黏蛋白为直接抑制对象，在成骨分化晚期抑制骨黏蛋白的表达水平，抑制成骨分化。

1.3.2miRNA与膜蛋白及胞内的四聚体 LI等[21]研究结果表明，miR-23a在成骨分化的过程中明显下调。过表达或下调miR-23a，体外hBMSCs的成骨分化受到相应抑制或促进。进一步实验证明，LRP5(Wnt蛋白的细胞膜受体蛋白)是miR-23a直接作用靶点，敲除LRP5可以抑制hBMSCs的成骨分化，与上调miR-23a的结果相一致。因此证实了miR-23a在的成骨分化中通过靶向LRP5，导致Wnt蛋白无法与受体结合，Wnt信号通路受到抑制，导致hBMSCs的成骨分化受到抑制。MENG等[22]发现上调miR-21可提高人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs)中成骨分化相关基因的表达水平，促进GSK-3β(Wnt信号通路中四聚体的成分之一)的磷酸化，使GSK-3β趋于稳定，细胞中β-catenin的积累增多，激活转录过程，促进成骨分化。这表明miR-21通过间接调节Wnt信号通路中的GSK-3β，来调控干细胞成骨分化过程。WANG等[23]探究hADSCs发现miR-26a通过直接靶向GSK-3β，抑制GSK-3β蛋白的表达，激活Wnt/β-catenin信号通路从而促进hADSCs的成骨分化。WANG等[24]研究hBMSCs的成骨分化过程的调控机制，发现炎症因子TNF-α可诱导转录因子NF-κB的激活，使miR-150-3p的表达上调，而miR-150-3p可与β-catenin mRNA的3′-UTR结合，降低细胞内β-catenin的水平，抑制hBMSCs的成骨分化。

1.3.3miRNA与非经典Wnt信号通路 LI等[25]研究小鼠脂肪源性间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)成骨细胞分化时，发现过表达的miR-26a-5p抑制成骨分化，而抑制内源性miR-26a-5p的表达可促进成骨分化。钙离子荧光探针和Western blot分析显示，mir-26a-5p抑制Wnt5a、蛋白激酶C(Wnt/Ca2+信号通路的相关因子)的表达及钙离子内流，从而抑制小鼠ADSCs的成骨分化。进一步研究发现，上调的miR-26a-5p通过靶向Wnt5a，抑制非经典Wnt信号传导通路Wnt/Ca2+信号通路，抑制ADSCs成骨分化。

尽管众多研究显示miRNA通过Wnt信号通路调节干细胞成骨分化，但鲜有研究从miRNA的视角出发探讨机械刺激的生物信号转导过程中干细胞成骨分化机制。

2 力学响应miRNA对干细胞成骨分化的影响

2.1成骨分化中的力学响应miRNA 力学刺激是细胞受到的最基础的刺激之一。近年来，研究发现力学因素对干细胞增殖和成骨分化起着重要的调节作用[26]。同时，发现一些在力学载荷作用下差异表达的miRNA，被称之为力学响应miRNA，可以响应力学刺激、调节细胞的增殖与成骨分化。其中大部分miRNA调控成骨分化的作用靶点未得到验证，另外有一小部分miRNA作用靶点已被验证[27]。文献[28]报道，对体外培养小鼠MC3T3-E1成骨细胞施加 12 dyn/cm2、1 h/d的周期性剪切应力刺激，基因芯片和实时荧光定量PCR检测到miR-20a、miR-21、miR-19b、miR-34a、miR-34c、miR-140和miR-200b明显下调，推测12 dyn/cm2、1 h/d的流体剪切应力可以促进成骨分化并且这些明显下调的miRNA可能参与成骨分化的调控。本课题组对体外培养小鼠MC3T3-E1成骨细胞施加2 500 με、0.5 Hz不同时长的张应变力学刺激，利用基因芯片和实时荧光定量PCR检测发现miR-218、miR-191、miR-3070a和miR-33的表达具有明显差异，表明这4种miRNAs可能是成骨分化过程中响应力学载荷的潜在调节因子[29]。WANG等[30]对MC3T3-E1细胞施加微重力和10 dyn/cm2、1 h/d流体剪切力这两种不同类型的力学载荷刺激诱导成骨分化，作用过后，通过RT-PCR检测发现受力前后miR-33-5p证实，Hmga2基因是miR-33-5p的靶基因，可抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。这表明miR-33-5p是一种力学响应miRNA，参与调控MC3T3-E1细胞在力学环境改变诱导下的成骨分化过程。

2.2力学刺激经Wnt信号通路影响成骨分化 有研究证明，机械刺激可通过Wnt信号通路影响干细胞向成骨细胞分化。SHI等[31]对大鼠肌腱干细胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)施加2%幅度、正弦波型、0.5 Hz、4 h/d的张应力刺激，发现TDSCs向成骨方向分化。用Ras同源基因家族成员A(ras homolog gene family member A，RhoA)的抑制剂下调RhoA的表达，抑制了张应力刺激下TDSCs的成骨分化；进一步研究发现，张应力刺激使TDSCs中的Wnt5a的mRNA水平增加。用小干扰RNA抑制Wnt5a的表达抑制了张应力刺激下TDSCs的成骨分化，而RhoA活化剂可使此过程恢复。因此，张应力刺激通过非经典Wnt/PCP(Wnt5a-RhoA)信号通路促进TDSCs的成骨分化。ZHANG等[32]发现给牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)施加100 kpa的静态压力，可使Wnt/β-catenin信号通路激活，从而调节PDLSCs成骨分化。DU等[33]证明0.5 Hz、2 000 με、2 h/d张应力刺激可激活Wnt/β-catenin信号通路和Wnt/Ca2+信号通路，促进hADSCs成骨分化。以上研究均证明机械刺激对干细胞的成骨分化作用与Wnt信号通路关系密切。

2.3力学响应miRNA经Wnt信号通路影响成骨分化 LI等[34]对体外培养的小鼠ADSCs施加0.5 Hz、2 000 με、2 h/d周期性张应力刺激，从miRNA的角度出发探讨在力学刺激作用下ADSCs成骨分化的力学传导机制。芯片结果显示ADSCs在张应力刺激下内源性miR-154-5p显著下调。荧光素酶报告基因分析证明Wnt11的3′-UTR是miR-154-5p的直接靶点。在力学刺激作用下，上调miR-154-5p的表达，结果显示ADSCs的成骨分化受到抑制；下调miR-154-5p的表达，可明显促进ADSCs的成骨分化。进一步的实验证明，miR-154-5p的过表达通过与Wnt11的mRNA的3′-UTR结合抑制其转录，降低Wnt11蛋白的浓度，从而抑制非经典Wnt/PCP(RhoA-ROCK)信号通路的激活，ADSCs的成骨分化也受到抑制；ADSCs的miR-154-5p下调后，可激活Wnt/PCP(RhoA-ROCK)信号通路，促进ADSCs的成骨分化。简言之，周期性张应力刺激下，miR-154-5p响应力学刺激，经Wnt/PCP信号通路靶向Wnt11调节ADSCs的成骨分化。

3 小结与展望

近年来，Wnt信号通路已渐渐为人们所重视，人类某些骨疾病，如骨质疏松症、硬化性骨化病，已证实与异常的Wnt信号通路相关[35-36]。这些发现需要研究者们对疾病的发病机制与Wnt信号通路在干细胞成骨分化的分子机制和调控机制进行更深层次的探索，以寻求治疗疾病的新思路和新方法。通过对特异性表达的miRNA的不断发现和靶点的验证，可能寻找到诊断骨疾病的新方法。另外，力学载荷是骨组织受到的最基本的刺激之一，在干细胞向成骨定向分化的过程中起关键的调节作用。研究miRNA影响干细胞成骨分化的途径及其调控机制离不开力学的环境。然而，现阶段对力学载荷作用下成骨分化过程中特异性表达的miRNA的研究尚处于起步阶段，许多与干细胞成骨分化相关的力学响应miRNA的作用靶点和调控机制并未得到验证，明确力学响应miRNAs的功能、调控机理、作用靶点、激活抑制因素及不同miRNA之间的相互作用和联系将是今后研究的重点。

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