Sestrin2对高迁移率族蛋白B1诱导树突细胞凋亡的保护作用

王丽雪，祝筱梅，董宁，任超，卢中秋，姚咏明

脓毒症(sepsis)是机体对感染反应失调所致的危及生命的器官功能障碍，包括全身炎症反应、免疫功能紊乱等病理过程[1]。在重症监护病房中，脓毒症的发病率高，治疗困难，是患者死亡的主要原因之一[2-3]。越来越多的证据表明，免疫功能障碍在脓毒症发生发展中具有重要作用，而树突细胞(dendritic cells，DC)凋亡是其关键环节之一[4]。在脓毒症及烧伤模型中脾脏DC显著减少，且DC凋亡及数量下降与脓毒症病情严重程度和不良预后密切相关[5]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是一种重要的脓毒症晚期细胞因子，参与脓毒症状态下多器官损害的发生与发展[6]。本课题组既往研究证实，HMGB1对DC的免疫功能具有双向调节作用，一定浓度的HMGB1刺激可诱导DC成熟，而高浓度HMGB1则可能导致DC的免疫应答反应降低[7]，但其确切的调控机制尚不明了。

Sestrins(SESNs)是一类在进化上高度保守的应激诱导蛋白家族，当细胞处于应激状态时其表达上调。SESNs广泛存在于动物体内，其中脊椎动物中具有3种SESNs基因，即SESN1、SESN2和SESN3[8]。Sestrin2(SESN2，亦称Hi95)是SESNs蛋白家族的重要成员，可被多种代谢应激条件激活，如缺氧、DNA损伤、氧化应激和内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)等。研究显示，SESN2表达活化在减少活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)聚集、维持能量平衡、增强细胞自噬、降低蛋白质合成、减缓代谢性疾病进展和调节细胞生长等方面具有重要作用[9]。本研究探讨HMGB1刺激对未成熟DC细胞系DC2.4中SESN2表达的影响，并通过干预SESN2基因表达进一步观察SESN2在HMGB1诱导的DC凋亡效应中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 小鼠树突细胞系DC2.4购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。重组人HMGB1(Sigma公司，美国)；兔抗小鼠SESN2单克隆抗体(Abcam公司，美国)；兔抗小鼠胱天蛋白酶(cleaved-caspase-3)多克隆抗体、兔抗小鼠Bcl-2单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology公司，美国)；SESN2 siRNA干扰病毒、SESN2 LV-RNA过表达病毒(上海汉恒生物科技有限公司)；藻红蛋白荧光素(PE)-Annexin V/7-AAD凋亡试剂盒(BD公司，美国)。辣根过氧化物酶(HRP)偶联羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗、ECL显影液、BCA蛋白定量试剂盒、预染蛋白Marker均购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 DC2.4细胞加入含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中，置37℃、5%CO2培养箱中培养，根据细胞生长状况每2～3d更换培养基继续培养或者进行细胞传代培养。实验一：将复苏后的DC2.4培养至3～4代后进行分组，包括正常对照组及HMGB1组，HMGB1组给予10ng/ml HMGB1分别刺激8、24、48h(n=4)；实验二：将细胞分正常对照组和1、10、100ng/ml HMGB1组(n=4)，分别给予相应浓度HMGB1刺激48h；实验三：将细胞分为过表达空载体组(NC)、过表达空载体HMGB1(100ng/ml)刺激组(NC+HMGB1)、过表达病毒组(LV-RNA)、过表达病毒HMGB1(100ng/ml)刺激组(LV-RNA+HMGB1)、沉默空载体组(NS)、沉默空载体HMGB1(100ng/ml)刺激组(NS+HMGB1)、沉默病毒组(siRNA)、沉默病毒HMGB1(100ng/ml)刺激组(siRNA+HMGB1)(n=4)。实验一、实验二分组分别用于SESN2表达及细胞凋亡的检测，实验三用于转染病毒后细胞凋亡的检测。

1.2.2 Western blotting检测蛋白表达 收集并裂解细胞，采用BCA法进行蛋白定量。SDS-PAGE电泳分离目的蛋白，采用半干转法将蛋白转移至硝酸纤维膜上，然后置于10%脱脂奶粉中室温封闭2h，一抗(1∶1000)4℃过夜、二抗室温孵育1h后，采用ECL显影试剂盒显影、成像，凝胶成像仪观察，Image J软件分析各组灰度值的强弱。

1.2.3 共聚焦激光显微镜(LSCM)观察SESN2在细胞中的定位 将不同刺激组细胞收集于流式管中，PBS清洗2次，4%多聚甲醛室温下固定30min，PBS清洗2次，0.2% Tritonx-100穿孔约20min；PBS冲洗2次，1% BSA封闭30min，加入一抗(1∶200)4℃孵育过夜，PBS清洗2次，加入荧光二抗(1∶500)37℃孵育1h，PBS清洗1次，将细胞重悬于约10μl PBS中，滴在盖玻片上，再滴加约5μl的封片液，在激光扫描共聚焦显微镜下观察蛋白的表达及其在细胞中的定位。

1.2.4 慢病毒转染 将DC2.4以2×106/ml密度接种于6孔板，参照汉恒生物科技有限公司的慢病毒使用说明书进行操作，转染作用10h后，换用含10%FBS的RPMI 1640完全培养基，继续培养3d，荧光倒置显微镜下观察转染后细胞绿色荧光(GFP)的表达。在最佳转染条件下(siRNA的MOI=30，LV-RNA的MOI=45，聚凝胺(polybrene)终浓度为6μg/ml；其流式检测GFP阳性率均＞90%)，将制备好的以上细胞按1.2.1中实验三的方法进行分组(n=4)，其中各HMGB1组给予浓度为100ng/ml的HMGB1刺激48h。

1.2.5 流式细胞术检测DC2.4细胞凋亡情况 取各组DC2.4细胞，PBS洗2次，加100μl缓冲液重悬细胞，按组别分别加入5μl PE-Annexin V和5μl 7-AAD，室温避光孵育15min，200μl缓冲液重悬细胞，1h内通过流式细胞分析仪检测凋亡率。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，进一步两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 HMGB1对SESN2蛋白表达的影响 与正常对照组比较，10ng/ml HMGB1刺激不同时间(8、24、48h)后，DC2.4细胞中SESN2蛋白表达水平逐渐升高，其中24h及48h的SESN2蛋白表达水平明显高于正常对照组及8h，且48h的SESN2蛋白表达水平明显高于24h，差异均有统计学意义(P＜0.05)；刺激8h时的SESN2表达水平有所下降，但与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05，图1A)。1、10、100ng/ml HMGB1刺激DC2.4细胞48h后，SESN2蛋白表达水平均明显高于正常对照组，且10、100ng/ml HMGB1刺激组SESN2蛋白表达水平明显高于1ng/ml HMGB1刺激组，差异均有统计学意义(P＜0.05，图1B)。

2.2 SESN2在DC2.4细胞中的定位及表达 共聚焦激光显微镜分析显示，SESN2蛋白在DC2.4中主要定位于细胞质及核周，100ng/ml HMGB1刺激48h后其表达较正常对照组明显增强(图2A、B)。

图1 HMGB1对DC2.4细胞中SESN2蛋白表达的影响(n=4)Fig. 1 Effect of HMGB1 on the expression of SESN2 in DC2.4 cells (n=4)

2.3 HMGB1对DC2.4细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响 采用上述实验一、二分组的细胞进行检测发现，与正常对照组比较，10ng/ml HMGB1刺激DC2.4不同时间，可诱导DC2.4凋亡逐步增加，以100ng/ml HMGB1作用48h最为显著；不同浓度(1、10、100ng/ml)HMGB1刺激48h均可诱导DC2.4凋亡增加，其中10、100ng/ml HMGB1作用48h后DC2.4细胞凋亡率(分别为17.02%±4.85%、17.48%±4.04%)明显高于正常对照组(7.35%±1.33%)，差异有统计学意义(P＜0.05，图3A)。Western blotting分析显示，10、100ng/mlHMGB1刺激48h后，DC2.4细胞中cleaved-caspase-3活性明显升高，100ng/ml HMGB1刺激48h后，DC2.4细胞中Bcl-2表达明显降低，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05，图3B)。

图2 SESN2蛋白在DC2.4细胞中的定位(共聚焦激光显微镜 ×400)Fig. 2 The localization of SESN2 in DC2.4 cells (laser scanning confocal microscopy ×400)FITC labeled SESN2 protein, the peak absorption is 488nm (green), DAPI stained nucleus, the peak absorption is 340nm (blue)

2.4 调控SESN2表达对HMGB1诱导DC2.4细胞凋亡的影响

2.4.1 转染LV-RNA和siRNA对SESN2表达的影响采用慢病毒转染技术转染SESN2 LV-RNA可显著上调DC2.4细胞中SESN2蛋白的表达，与正常对照组及空载体组比较差异有统计学意义(P＜0.01，图4A)；而转染SESN2 siRNA后DC2.4细胞中SESN2蛋白表达与空载体组比较明显下调(P＜0.05)，但与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05，图4B)。

2.4.2 干预SESN2基因表达对HMGB1诱导的DC2.4细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响 与空载体组比较，SESN2 LV-RNA转染组HMGB1诱导的DC2.4细胞凋亡率明显降低(35.57%±1.69%vs.49.04%±4.87%，P＜0.05，图5A、C)，且DC2.4细胞中cleaved-caspase-3活性明显下降(P＜0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显增高(P＜0.05，图5E)。与空载体组比较，转染SESN2 siRNA沉默SESN2基因表达后，HMGB1诱导的DC2.4细胞凋亡率明显增高(65.96%±2.50%vs. 50.01%±2.07%，P＜0.05，图5B、D)，且DC2.4细胞中cleaved-caspase-3活性明显升高、抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05，图5F)。

图3 HMGB1对DC2.4细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响(n=4)Fig. 3 Effect of HMGB1 on the cell apoptosis of DC2.4 cells and the expression of apoptosis related protein (n=4)

图4 转染SESN2 LV-RNA和SESN2 siRNA对DC2.4细胞中SESN2蛋白表达的影响(Western blotting，n=4)Fig. 4 Effect of LV-RNA or siRNA transfection on the expression of SESN2 in DC2.4 cells (Western blotting, n=4)

3 讨　论

脓毒症是一种复杂的感染并发症，涉及许多交叉级联反应的激活，包括炎症、凝血、氧化应激和细胞凋亡等[10]。在脓毒症的发展过程中，免疫细胞(如DC、T淋巴细胞和巨噬细胞等)的凋亡可导致免疫功能紊乱、多器官功能障碍，甚至引起死亡[11]。DC是体内重要的抗原提呈细胞(APC)，是连接固有免疫与适应性免疫的桥梁[12]，其凋亡在脓毒症免疫功能异常中具有重要意义，与脓毒症患者预后密切相关[5]，而胞外分泌的HMGB1可调节DC的成熟、活化及凋亡[13]。本课题组前期研究证实，HMGB1作为一种潜在的免疫调节因子，参与调节DC和T淋巴细胞的免疫应答及凋亡，但其确切调控机制仍不明确[7,14]。

研究证实，SESNs可通过抑制哺乳动物西罗莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)蛋白激酶活性、抑制ROS积聚，保护机体免受多种应激损伤，对细胞生长及存活具有保护性作用[15]。SESN2是SESNs蛋白家族的重要成员，作为p53蛋白的底物，与细胞凋亡密切相关。在心血管疾病模型小鼠的巨噬细胞中，上调SESN2的表达可有效减轻ox-LDL诱导的细胞凋亡，提示SESN2对于脂质相关性心血管疾病具有保护作用[16]。另有资料显示，在LPS诱导的小鼠脓毒症模型中，SESN2表达水平较正常对照显著上调，而SESN2–/–缺陷小鼠表现为线粒体自噬缺失，最终造成过度炎症反应及死亡率增加[17]。上述研究表明SESN2在炎症性疾病中具有重要作用。本研究进一步探讨了SESN2在HMGB1诱导的DC凋亡中的作用及调节机制，旨在为深刻揭示其免疫学效应和干预途径奠定理论基础。

本实验结果显示，较高剂量HMGB1刺激可诱导DC2.4发生明显凋亡，其中100ng/ml HMGB1刺激48h最为显著，与本课题组前期研究结果一致[18]。SESN2在正常DC2.4中存在表达，HMGB1刺激后其表达明显上调，尤以10、100ng/ml HMGB1作用48h组最为明显；激光共聚焦激光显微镜观察显示，SESN2主要表达于胞质及核周，100ng/ml HMGB1刺激48h后，SESN2表达明显增强，可能与DC在HMGB1刺激下发生成熟异常、功能受损及凋亡有关。本组资料提示，HMGB1对DC2.4细胞凋亡的影响以100ng/ml刺激48h最为明显，因此重点分析了转染SESN2 LV-RNA和siRNA后经100ng/ml HMGB1刺激48h DC2.4细胞凋亡的改变。采用慢病毒转染技术进行观察发现，与空载体组比较，siRNA转染可有效沉默SESN2基因，下调SESN2蛋白的表达，加剧HMGB1诱导的DC2.4细胞凋亡，凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3活性明显增强，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降；而转染SESN2 LV-RNA可显著上调SESN2蛋白的表达，减轻HMGB1诱导的DC2.4细胞凋亡，凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3活性明显下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显增加。上述结果提示SESN2对HMGB1诱导的DC2.4细胞凋亡具有明显的保护作用[19]。

图5 干预SESN2基因表达水平对HMGB1诱导的DC2.4细胞凋亡的影响(n=4)Fig. 5 Effect of regulating the gene expression of SESN2 on DC2.4 apoptosis induced by HMGB1 (n=4)

综上所述，本研究结果表明，HMGB1刺激后DC2.4细胞凋亡率和SESN2蛋白表达水平均明显上调，沉默SESN2基因后HMGB1诱导的DC2.4细胞凋亡明显增加，而上调SESN2基因表达对HMGB1诱导的DC2.4细胞凋亡具有保护效应，但其确切信号通路和关键调节环节仍有待深入探讨。进一步深入认识脓毒症状态下SESN2对免疫细胞凋亡的影响与作用，将为脓毒症的免疫调理提供新的思路。

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