雪莲细胞培养物活血化瘀及抗炎作用研究❋

王彦礼，刘雅萍，高俊鹏，王敦方，徐航宇，马旭冉，杨伟鹏△

(1. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700； 2. 大连普瑞康生物技术有限公司，大连 116001； 3. 神威药业集团有限公司，石家庄 051430)

天山雪莲(saussurea involucrate (kar．et Kir) Sch．Bip) 是我国珍稀的名贵药材，具有活血通经、散寒除湿、强筋助阳等功效，在民族地区常用来治疗风湿、妇女痛经、月经不调等疾病[1]。由于天山雪莲生长环境特异，生长缓慢，人工栽培困难，加之过度采挖致使雪莲资源匮乏，而采用植物细胞工程技术对雪莲进行细胞培养，能生产出质量稳定、药效成分高的雪莲细胞培养物，并可大规模工业化生产，此技术可有效解决雪莲药材短缺的问题[2]。本研究观察雪莲细胞培养物对急性血瘀模型大鼠的活血化瘀作用及抗子宫内膜异物炎症的作用，为临床应用雪莲细胞培养物治疗妇科疾病提供实验方面支持。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Wistar大鼠，体质量180～200 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(合格证号SCXK-(军)2012-0004)。

1.2 药物

雪莲细胞培养物(20166，批号H130401)，大连普瑞康生物技术有限公司；阿司匹林(sigma，批号20120928001)；盐酸肾上腺素注射液，天津金耀氨基酸有限公司(批号1307051)；ADP血小板聚集功能检测试剂盒，山东泰利信医疗科技有限公司(批号20160927B)；纤维蛋白原FIB含量测定试剂盒，上海太阳生物技术有限公司(批号132090)。

1.3 仪器

LBY-N6K自动血液流变仪、LBY-NW1毛细管黏度计、C2000-4血凝仪、LBY-NJ4血小板聚集仪，北京普利生仪器有限公司；KH-120 M毛细管离心机，日本产；KUBOTA红细胞压积读数板、TGL-16型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；SN-695型智能放免γ测量仪，上海原子核研究所日环仪器一厂生产。

1.4 分组及造模

1.4.1 取雄性大鼠60只，按体质量随机分出10只作为空白对照组，其余50只大鼠分为血瘀模型组、雪莲细胞培养物高、中、低3个剂量组和阳性药阿司匹林组。雪莲细胞培养物按照140、70、35 mg/kg 3个剂量(相当于人用剂量3.33 mg/kg/d的40、20、10倍)，阳性药阿斯匹林按照100 mg/kg灌胃给药，空白对照组和模型组给予同体积溶剂，每日1次，持续7 d。于第7天皮下注射肾上腺素1 mg/kg共2次，间隔4 h，在2次注射之间，将大鼠浸入冰水内5 min处置后禁食，次日取血进行血液流变学检测[3]。

1.4.2 取雌性大鼠60只，用1.6%戊巴比妥钠麻醉，剪去下腹部毛酒精消毒，于下腹正中切口2 cm，暴露子宫，沿左侧子宫角上1 cm处作一横切口，将消毒后的塑料管(2 mg)放置子宫内缝合固定，滴入青霉素以防感染[4]。次日，将手术后的大鼠按体质量随机分为模型组、阳性药阿司匹林组、雪莲细胞培养物高、中、低剂量组共5组。雪莲培养物按照140、70、35 mg/kg 3个剂量(相当于人用剂量3.33 mg/kg/d的40、20、10倍)，阳性药阿斯匹林按照100 mg/kg灌胃给药，模型组给予同体积溶剂，每日1次，连续7 d。

1.5 检测指标

1.5.1 将1.4.1的禁食大鼠20%乌拉坦腹腔麻醉，腹主动脉采血5 ml，按9∶1的比例将全血与3.8%的枸橼酸钠溶液混匀抗凝，取6 ml抗凝血用于血小板、全血黏度和红细胞压积的测定，余3 ml 3000 r/min离心15 min以分离血浆，用于血浆黏度和血浆纤维蛋白原含量的测定。将旋转式黏度计设定剪切率为10、200 s-1，检测温度37 ℃，加入710 μL抗凝全血，观察并记录其不同切变率下的全血黏度；红细胞压积的测定用微量血细胞比积法：取∮1.5×75 mm的毛细管吸取0.2 ml抗凝血，一端封闭，12000 r/min离心5 min，用刻度板读数，读数/0.9以去除抗凝剂的影响；血浆纤维蛋白原(Clauss法)按试剂盒说明书在血凝仪上进行测定。

1.5.2 将1.4.2的大鼠末次给药1 h后取血分离血清，放免法检测肿瘤坏死因子TNF-α，处死动物摘取致炎侧和非致炎侧子宫，称重并计算肿胀率和抑制率。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 雪莲细胞培养物对急性血瘀模型大鼠的活血化瘀作用

表1显示，模型组与对照组比较红细胞压积无明显变化，血浆纤维蛋白原含量、血小板聚集率、血浆黏度、全血黏度均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，说明急性血瘀模型造模成功。雪莲细胞培养物低剂量组可明显降低血浆纤维蛋白原含量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；雪莲细胞培养物高、中、低剂量组可明显降低全血黏度10、全血黏度200，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，对于红细胞压积、血小板聚集率以及血浆黏度无明显影响。

表1 雪莲细胞培养物对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响

注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.2 雪莲细胞培养物对大鼠子宫内膜异物炎症的作用

表2显示，雪莲细胞培养物高、中、低剂量组均可以降低致炎子宫的肿胀率，体现出一定的量效关系，其中高、中剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；雪莲细胞培养物高、中、低剂量组均可明显降低血清中TNF-α含量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 雪莲细胞培养物对子宫异物炎症及TNF-α的影响

注：与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

天山雪莲在民族地区常用来治疗妇科疾病，如痛经、月经不调等。雪莲细胞培养物具有与野生雪莲相近的抗炎、镇痛、免疫抑制等作用[5-6]，且黄酮等有效成分含量高于野生雪莲[7]。目前，雪莲细胞培养物已被批准为新资源食品，多种保健功能已得到证实[8-9]，但目前针对雪莲治疗妇科疾病的实验研究尚少。

中医理论认为“大怒致瘀”“外寒也可致瘀”。本研究采用给予大鼠皮下注射大剂量肾上腺素模拟暴怒时的机体状态，并以冰水浸泡模拟寒邪入侵，在两种因素综合作用下复制大鼠急性血瘀证模型。肾上腺素为α和β受体激动剂，具有收缩外周血管和增加心肌收缩力的作用，使心脏负荷增加，心肌耗氧代谢增加，心功能下降，从而使血液运行障碍，血液黏度增加，加之液体的黏度在温度降低时升高，再给动物施以冰水冷浴。二者的综合作用使得模型组除红细胞压积指标没有明显变化外，其余各项血液流变学指标均较正常组显著升高，复制出血液流变性呈“黏、浓、凝、集”的血瘀状态。

血液流变学的主要指标是全血黏度、血浆黏度以及红细胞聚集指数等，其水平的增高是导致血液高黏滞及血栓形成的重要原因；全血黏度增高是血液黏滞度增高的根本，主要与红细胞聚集增强有关，而低切变率下的全血黏度在一定程度上反映红细胞聚集能力；血浆黏度增高是导致血液黏度增高的原因之一，与血浆无形成分的改变有关[10]。

本文采用冰水浴和注射肾上腺素结合的方法造成大鼠血瘀模型。本研究结果显示，雪莲细胞培养物可以明显降低急性血瘀模型大鼠的全血黏度，对血浆纤维蛋白原也有一定的降低作用，说明雪莲细胞培养物具有一定的活血化瘀作用。

肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种具有多种生物学活性的细胞因子。正常水平的 TNF-α可以参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染, 促进组织修复,引起肿瘤细胞凋亡等,但TNF-α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡,与其他炎症因子共同产生多种病理损伤, 如类风湿关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病等多种疾病[11]。子宫内膜异物可导致子宫内膜炎症的发生，使致炎子宫出现不同程度的肿胀。雪莲细胞培养物可以降低致炎子宫的肿胀程度，并可以明显降低致炎大鼠血清中炎症介质TNF-α的含量，说明雪莲细胞培养物对于子宫内膜异物引起的炎症具有一定的抑制作用。

综上，雪莲细胞培养物具有一定的活血化瘀和抗妇科炎症的作用。本结果对于雪莲细胞培养物应用于妇科疾病的治疗提供了一定的理论基础和实验依据。

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