通幽汤对食管鳞癌细胞MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达的影响

刘正端，刘丽娜，刘 源，王延朋，尹先哲，赵智伟

(1. 河南南阳市第二人民医院，河南 南阳 473012； 2. 河南科技大学第一附属医院,河南 南阳 473000)

食管癌在我国发病率和死亡率居高不下，肿瘤细胞的侵袭和转移是其生存率低下的主要原因。现有研究表明[1]，MMP-2、MMP-9和N-cadherin在肿瘤细胞中高表达，TIMP-1、E-cadherin低表达，这些细胞因子和蛋白参与细胞的侵袭和转移过程。通幽汤是治疗食管癌的传统名方，临床应用能明显改善患者症状和预后，但对该方的作用机制尚无研究。本研究运用细胞药理学方法观察通幽汤对食管鳞癌细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1、 钙黏联蛋白的含量影响。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

《脾胃论》所载通幽汤组成：红花 0.3 g，桃仁泥 0.3 g，生熟地各 1.5 g，当归 3 g，炙甘草 3 g，升麻 3 g，槟榔1.5 g，由河南中医学院第一附属医院中药房配制。食管鳞癌细胞株KYSE150(上海细胞生物研究所)；DMEM培养基(GIBCO 公司)；胎牛血清(Hyclone 公司)；胰蛋白酶(华美公司)； 1640培养基(BI，美国)；FBS(BI，美国)；CCK-8试剂盒(同仁化学，日本)； ELISA 试剂盒(Santa Cruz 公司)；MMP-2、MMP-9、N-cadherin单克隆抗体(Sigma公司)；TIMP-1、E-cadherin单克隆抗体(Sigma 公司)；GAPDH单克隆抗体(Abcam公司)；BB-94 (Oxford, 英国)；transwell试剂盒(Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 使用10%胎牛血清(FBS) DMEM培养液(含青链霉素 100U/mL)进行细胞培养，培养条件为37 ℃5%CO2。

1.2.2 中药配制 使用《脾胃论》所载通幽汤原方加入 25倍体积去离子水，浸泡 30 min大火煮沸，小火继续煎煮约 45 min收集药液，烧杯中浓缩至 200 mL，6000 r/min×30 min 高速离心取上清， 计算方药提取物浓度，培养液配制浓度至 500μg/μL，超净工作台过滤分装，-20 ℃保存备用。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖情况 将处于对数生长期的KYSE150细胞制成单细胞悬液， 1×104/孔接种于96 孔板中， 37 ℃ 5%CO2条件下培养， 24 h 后弃上清，加入含方药提取物的培养液 100 μL，终浓度分为6400～100μg/mL范围内，倍比稀释7个浓度梯度，每组5个复孔，以常规培养的细胞作为阴性对照，并留取空白孔调零，分别于24 h、 48 h、72 h后加入 10 μL /孔的 CCK-8溶液， 4 h后在450 nm处检测OD值。横坐标为药物浓度，纵坐标为抑制率，绘制抑制曲线，并得出半数抑制浓度 (IC50)。按下列公式计算抑制率： 肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组 OD 值/对照组 OD 值)×100%。

1.2.4 通幽汤全方对肿瘤细胞凋亡的影响 在腔室培养瓶中接种处于对数生长期的KYSE-150细胞，每瓶约1×104个细胞，24 h后按0和812μg/mL浓度加入通幽汤方药提取物，再培养24 h取下细胞爬片，PBS漂洗2遍，加入配好的凋亡染液，室温避光孵育15 min，荧光显微镜下观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，Propidium iodide (PI) 荧光信号呈红色。

1.2.5 划痕愈合实验 在6孔板的每孔背后，约每隔0.5～1 cm划一道横线，每孔5条横线。 每孔中加入约5×105个细胞常规培养，12 h后垂直于横线划痕。PBS洗3次，无血清培养基继续培养。实验组加入终浓度812μg/mL的提取物。阳性对照组为40 ng/mL的BB-94，放入37 ℃ 5% CO2培养箱培养。可按0、6、12、24 h时间点取样、拍照。

1.2.6 transwell实验 用50 mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室上室面的底部膜。24孔培养板中实验组细胞每孔加入含方药提取物终浓度812μg/mL的500 μl无血清培养基，阴性对照组为500 μl的无血清培养基，阳性对照组为含有40 ng/mL BB-94的培养基，37 ℃ 24 h。消化细胞用无血清培养基重悬，调整细胞密度至1×105/mL。将小室放入另外一个加有10%FBS培养基的24孔培养板中，在上室加入300 μL细胞悬液，常规培养48 h。结晶紫染色，显微镜下拍照，随机选取5个视野进行计数并计算迁移率，各组实验均重复 5 次。

1.2.7 蛋白提取 将各组细胞冰上收集、离心、裂解，15000 r/min离心20 min取上清，Bradford法测蛋白浓度，-20℃保存备用。

1.2.8 培养上清液中MMP-9、MMP-2和TIMP-1含量 收集各组食管鳞癌细胞培养上清液，用ELISA法检测MMP-2、MMP-9、TIMP-1含量，将一抗用包被稀释液(0.05 mol/L PH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释后加入96孔板中，37 ℃ 4 h弃去孔中液体。 封闭(5% BSA)酶标反应孔，加入待检测各组样品，放入37℃40 min洗涤3遍， 加入酶标抗体和底物液，37 ℃避光5 min。加入终止液终止反应，450 nm波长吸光度(OD值)。将样品OD值代入用标准物浓度与OD值计算出的直线回归方程式中，计算出样品浓度再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.2.9 Western blot 分析方法 灌胶、上样、电泳、转移、染色，封闭1 h，4℃条件下一抗孵育过夜、洗膜，抗兔二抗孵育， ECL 显影，GAPDH为内参。

2 统计学方法

3 结果

3.1 通幽汤对 KYSE150 细胞增殖的影响

图1显示， 不同浓度的通幽汤全方对 KYSE150细胞增殖的抑制程度不同，抑制率与药物浓度呈量效依赖性关系， 6400 μg/mL的药物浓度作用24 h、48 h和72 h后药物抑制率都大于 93.6%。 3个时间段的 IC50值分别是24 h组 IC50=1540 μg/mL，48 h组 IC50=1290 μg/mL，72 h组 IC50=1108 μg/mL。

3.2 通幽汤显著增加

图2显示，KYSE-150细胞凋亡敏感性812μg/mL浓度的药物处理KYSE-150细胞24 h，先后用Annexin V-FITC和PI染色，10×倍镜下取3个不同视野进行计数，发现通幽汤能够同时增加早期和晚期凋亡的敏感性(P<0.05)。

3.3 划痕实验结果

图3表1显示，与阴性对照组食管鳞癌细胞比较，实验组细胞的体外迁移能力受到明显的抑制，48 h后实验组细胞划痕的愈合程度明显小于阴性对照组，该结果说明通幽汤可以抑制KYSE150细胞的体外迁移能力(P<0.05)。

表1 各组KYSE150细胞划痕后愈合程度比较

注：与阴性对照组比较:*P<0.05

3.4

图4显示，Transwell实验结果与阴性对照组食管鳞癌细胞比较，通幽汤处理后KYSE150细胞的侵袭能力下降。阴性对照组、阳性对照组、实验组各组跨膜的细胞数分别为(171±13.4)、 (66.2±7.35)、 (76.8±9.19)，差异有统计学意义(P<0.05)。

3.5 各组细胞培养上清液水平比较

表2显示，各组食管鳞癌细胞培养上清液中MMP-9、MMP-2和TIMP-1含量比较，对照组与实验组比较MMP-9和MMP-2表达水平下降(P<0.05，P<0.05)，TIMP-1水平升高(P<0.05)。

表2 各组KYSE150细胞培养上清液中MMP-9、MMP-2和TIMP-1水平比较

注：与阴性对照组比较：*P<0.05

3.6 通幽汤对转移相关蛋白表达的影响

图5显示，Western-blot 法结果表明，通幽汤作用KYSE150 细胞48 h后， MMP-9、MMP-2和N-cadherin等促转移蛋白与对照组比较明显减少(P<0.05)， TIMP-1蛋白和E-cadherin蛋白明显增加(P<0.05)，说明通幽汤能够抑制食管癌细胞转移相关蛋白的表达。

4 讨论

过去癌症的研究主要集中在癌细胞突变方面的研究，因为突变可以让细胞增殖或永生。肿瘤微环境是影响癌症恶化的关键因素。细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 成分的降解是肿瘤的浸润与转移的关键，基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs) 能降解 ECM，而 MMPs的活性与金属蛋白酶组织抑制剂 (tissueinhibitor of metalloproteinase, TIMPs) 有关[3]。MMP-2、MMP-9、N-cadherin在癌细胞中高表达，TIMP-1、E-cadherin在癌细胞中低表达，它们与细胞的侵袭转移密切相关。基质金属蛋白酶几乎存在于所有的人类癌症中，它们可以在健康的成纤维细胞中表达，在与癌症相关的成纤维细胞或着癌细胞中表达，这个现象意义重大。因为基质金属蛋白酶可以影响肿瘤微环境，包括血管生成、肿瘤生长和转移[4-5]， 因此MMP的表达与肿瘤侵犯、肿瘤分期和预后相关[6-7]。MMP的转录表达被十分严格的控制，其表达量通常很低。进一步的调控发生在翻译后修饰，修饰需要酶的参与，但是修饰酶的表达与组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs) 存在共表达的关系[8]。许多研究表明，TIMP-1可以抑制MMPs的表达，发挥抑制肿瘤细胞转移[9-10]，从而达到调控MMP表达的监管作用。病理条件下这些监管机制的失调可能会导致疾病的恶化。

中医学将食管癌归为噎膈范畴辨证论治。病机早期气机不畅、津液凝结成痰，继续发展为气滞血瘀、痰郁生火，晚期气微阳虚、津亏血燥；治疗以早期治标为主，理气化痰降火；晚期治本为要，滋阴润燥或补气温阳。临床上，该病确诊时大部分已到中晚期，因此几乎所有的患者都存在程度不一的血行瘀滞内停的病理变化，主要临床表现有肿块、疼痛、舌质暗紫等。许多临床实验研究发现，恶性肿瘤患者普遍存在血液高凝状态[2]，而且随着肿瘤的发展高凝状态有逐渐加重的趋势，因此血液的高凝状态与肿瘤的发展有着密切的联系。血液高凝也往往伴随MMPs表达水平的升高[11]。虽然中医所说的血瘀与目前临床所讲的血液高凝状态概念和使用范围有所不同，但血液的高凝状态是中医所讲血瘀的一种。通幽汤是中医治疗食管癌的传统名方，现代临床运用能明显改善患者的症状和预后。原方的桃仁、红花对于改善血液高凝状态疗效明显[12]，再加上通幽汤临床应用能明显改善患者症状和预后，由此可推断通幽汤有可能通过破结行瘀的作用，发挥抑制食管癌细胞侵袭转移、缓解食管癌症状的作用。

本研究以《脾胃论》所载通幽汤原方为研究对象，用生地、熟地、当归滋阴养血固其本；桃仁、红花破结行瘀；升麻升清降浊，升降相因；槟榔末破积降气；甘草调和诸药，全方具有养血理血、调理气机之功效。临床上通幽汤配合西药化疗，一方面加强疗效，另一方面也可以治疗缓解化疗造成的吐逆等消化道反应。体外细胞实验是药物实验的基础，体外细胞学实验证明，通幽汤能够抑制食管癌细胞的增殖、侵袭和迁移。分子机制研究表明，通幽汤能够下调MMP-2、MMP-9、N-cadherin表达，上调TIMP、E-cadherin的表达，从而抑制癌细胞的侵袭和迁移，为通幽汤的临床应用提供客观的分子基础依据。BB-94(batimastat，BB-94)是人工合成的金属蛋白酶抑制剂，能够抑制MMPs的酶活性，进而抑制癌细胞的侵袭和迁移。本研究用BB-94作为阳性对照组的处理药物。

本研究是在通幽汤原方的基础上进行的，临床应用宜根据辨证论治的结果，方药加减变化灵活，从不同的临床需要出发，发挥更大更全面的临床治疗效果。

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