中华蜜蜂促分裂原活化蛋白激酶ERK-A基因的克隆与低温表达分析

陈文凤 张卫星 王红芳 胥保华

（山东农业大学动物科技学院，泰安 271018）

细胞对环境变化的反应部分是由一系列胞内信号途径来诱导的，信号通路接替、放大并整合来自胞外刺激的信号，最终导致基因和生理的改变。昆虫为适应极端环境，体内会启动一系列代谢和调控反应。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路参与细胞的生长、发育、分化、凋亡等多种生理过程，不仅应答生物胁迫中的病原体感染，也对盐、高温、低温、干旱等非生物胁迫有响应[1,2]。MAPK信号通路主要由ERK（extracellular signalregulated kinases）、JNK（The c-Jun amino-terminal kinases）和p38等并行的几条信号通路组成。JNK主要参与细胞的转录调控，p38主要参与细胞对炎症因子和环境胁迫（UV、温度、缺血缺氧）的响应，而ERK信号通路主要参与调控细胞分裂过程。ERK信号通路在MAPK信号通路中最早被发现且研究得最为深入。ERK包括ERK-1和ERK-2两种激酶，该途径主要介导有丝分裂信号向胞内和核内传递，调控细胞的生长过程[3]。

应激反应是受细胞内信号系统调节的复杂过程，MAPK、G蛋白耦联受体以及TGF-β等信号通路都参与应激反应[4,5]。当动物处于冷应激条件下时，动物机体作为一个整体发生反应，其神经内分泌系统、心血管系统、消化系统以及免疫系统等均发生一系列多系统、多层次的协调效应，以提高机体的适应能力和维持内环境的相对稳定。动物应激及动物对应激原的适应具有分子基础，可以认为是一种基因行为[6,7]。任何机体酶和蛋白质的差异，其根本原因是基因表达的差异。在冷应激过程中主要表现为蛋白合成率的总体下降，但是某些蛋白的合成反而上升或严重下降，说明他们的表达受到了冷应激的特异性调节，并可能在冷应激过程中扮演重要角色[8]。ERK-A信号通路可将胞外刺激与胞内功能联系起来，通过研究ERK信号通路调节机制可以了解冷应激对细胞活动的影响。研究发现，ERK通路通过调节类固醇和山梨醇的合成来终止家蚕幼虫的滞育过程，表明ERK通路参与了昆虫在低温条件下的代谢调节[9,10]。

虽然对蜜蜂抵抗低温的生理生化机制已有很多研究[11]，但信号通路在中华蜜蜂低温响应机制中的作用还鲜有报道，本研究通过将中华蜜蜂成虫置于4℃环境下4 h，并在处理过程中取样，取样在3 min内完成，取样后立即将蜜蜂放回原处理条件下。利用实时定量PCR检测ERK-A基因的表达量，探讨ERK-A基因是否在中华蜜蜂适应低温环境中发挥作用。

1 材料与方法

1.1 供试蜂种

中华蜜蜂（简称中蜂，A.cerana cerana），饲养于山东农业大学实验研究基地。

1.2 主要试剂

BL21（DE）和感受态细胞DH5α购自北京全式金生物技术有限公司，克隆载体pEasy-T3购于TransGen公司，原核表达载体Pet-30a(+)由本实验室提供。TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTP、DNA Marker、SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit、各种限制性内切酶购于宝生物工程(大连)有限公司（TaKaRa）；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于Solarbio公司；质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit购于OMEGA公司；引物合成和测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3 PCR引物（表1）

表1 PCR引物

1.4 中华蜜蜂ERK-A基因的生物信息学分析

利用DNAMAN 6.0软件将ERK-A基因的开放读码框翻译成氨基酸序列，得到蛋白，在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上将ERK-A同其它物种进行Blast同源比对。在亚细胞定位预测网站(http://psort.hgc.jp/form.html)上预测该蛋白质在细胞中的位置，利用MEGA 5软件对不同物种ERK-A基因序列进行多重比对，通过NJ(neighbor joining)方法构建系统进化树。

1.5 中华蜜蜂的低温处理

选取正常蜂群中的中华蜜蜂320只，分成4组，每组80只，随机选取三组在4℃冰箱中放置15 min、30 min、1 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h，另一组放置于25℃恒温恒湿培养箱中，处理后直接将蜜蜂冻存在液氮中，将25℃饲养的蜜蜂成虫作为对照，不作低温处理直接冻存在液氮中，以单只蜜蜂为一个样品，每个处理共3只蜜蜂（即3次重复)。

1.6 中华蜜蜂总RNA的提取、cDNA的合成以及实时荧光定量PCR

每群选取2只蜜蜂液氮研磨，Trizol法提取总mRNA，然后使用反转录试剂盒（TaKaRa：DRR037A）立即反转录为cDNA，调节样品cDNA浓度于相同水平后，-20℃保存备用。qRT-PCR取1000 ng cDNA加入到20 μl荧光定量体系中，按照荧光定量试剂盒（TaKaRa）操作指南，用7500 Real-Time PCR仪（ABI 7500，USA）检测目的基因相对表达量。反应程序：预变性95℃，10 s；变性95℃，5 s；退火60℃40 s，40个循环，熔解曲线添加，1个循环。目的基因引物设计参考序列来自于NCBI数据库，以action为内参，采用Primer 5.0进行引物设计，委托生工生物科技有限公司合成引物。

2 结果与分析

2.1 中华蜜蜂ERK-A基因cDNA的克隆（图1）

图1 ERK-A基因克隆

2.2 中华蜜蜂ERK-A基因cDNA的序列分析

通过DNAMAN 6.0软件进行分析获得中华蜜蜂ERK-A基因的开放读码框，含有1098 bp的碱基，编码365个氨基酸，编码蛋白质命名为ERK-A，其分子量为42 kDa，等电点为6.03。ERK-A1/2 是细胞对外界信号产生应答的上游枢纽，通过亚细胞定位预测(http://psort.hgc.jp/form.html)，ERK-A主要存在于细胞质中，且无信号肽编码序列，无跨膜结构(图2)。ERK-A具有MAPK超家族的序列特征，即存在激酶的保守区和磷酸化位点(下划线标的TEY序列)。

图2 中华蜜蜂ERK-A的核酸与氨基酸序列

2.3 中华蜜蜂ERK-A蛋白的同源性分析

图3 中华蜜蜂与其他物种的同源比对

将ERK-A的氨基酸序列在NCBI网站进行Blast比对，结果表明ERK-A与同为蜜蜂科Apis mellifera（GenBank登录号：XP_393029.2）的相似性最高，一致性99.18%，与Harpegnathos saltator （GenBank登录号：XP_017789097.1）的一致性97.81%。与Eufriesea Mexicana和Melipona quadrifasciata的一致性都在97%以上（图3），说明该基因在进化上高度保守。

2.4 中华蜜蜂ERK-A基因的三维结构预测及磷酸化位点分析

MAPK的激活都是通过TEY基序中苏氨酸(T)和酪氨酸（Y）的同时磷酸化实现的。利用SWISSMODEL（http://www.swissmodel.expasy.org/）预测ERK-A激酶的三级结构（图4），可以看出，N端结构域主要由β折叠组成，C端结构域主要由α螺旋组成，两个结构域之间的裂痕(即无规则卷曲)为ATP结合的激活环，TEY基序就位于激活环内[12]。

图4 ERK-A的三维结构剖面图

2.5 中华蜜蜂ERK-A激酶与其他物种ERK-A激酶的系统树构建

从NCBI网站下载相近物种的部分ERK-A激酶序列，利用MEGA软件，以酵母Saccharomyces merevisiae的ERK-A作为外群，通过Test Neighbor Joining Tree方法构建以氨基酸序列为基础的系统发生树（图5），结果表明：中华蜜蜂ERK-A和同为蜜蜂科的意大利蜜蜂Apis mellifera的ERK-A聚为一支，与蚁科的收获蚁Pogonomyrmex barbatus和拟步甲科的赤拟谷盗Tribolium castaneum亲缘关系较近。小鼠ERK-A和人ERK-A聚为一支，昆虫ERK-A与哺乳动物ERK-A有更近的起源。

图5 昆虫ERK-A的系统进化树

2.6 低温胁迫下中华蜜蜂ERK-A基因的表达规律

为了研究ERK-A基因的表达是否对低温胁迫做出响应，进行实时荧光定量PCR检测。荧光实时定量PCR结果显示，在低温胁迫下ERK-A的表达均有显著上调。在4℃胁迫30 min后，ERK-A的表达量就达到对照的2倍，2 h时达到最高峰是对照的4倍，此后虽有下降，但仍保持较高水平（图6）。低温表达分析说明，ERK-A基因的表达受到低温的诱导，可能在中华蜜蜂应对低温胁迫时发挥对细胞的调控作用。

图6 低温条件下ERK-A基因表达的变化

我们从蜜蜂转录组数据库中获得ERK-A基因的cDNA序列的完整开放阅读框长1098 bp，编码365个氨基酸，编码蛋白ERK-A的分子量为42 kDa，等电点为6.03。同源性分析发现，该基因在进化上十分保守，在氨基酸水平上，与相近物种的ERK-A的一致性都达到97%以上，与意大利蜜蜂ERK-A的一致性达99.18%，表明ERK-A在生物体中都具有重要功能。本研究发现ERK-A在4℃呈上调表达，说明ERK-A通路可能参与了中华蜜蜂耐寒机制的调控。

3 结论与讨论

真核细胞已经形成了特殊的信号转导通路来响应细胞外的各种刺激，丝裂原蛋白激酶MAPK组成了一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，通过磷酸化作用激活受体，调节细胞的增殖、分化和胁迫响应[13]。在比较生物化学领域，MAPK信号通路在代谢调节和生化适应方面的研究还比较少见，最初关于MAPK信号通路在缺氧状态、热应激和冷应激等方面的代谢应答的研究也仅仅触及其表面[14]。

通常认为，ERK通路主要参与细胞存活和生长繁殖，其有效激活信号分子包括生长因子、激素、神经递质、钙离子等[15]，而p38和JNK主要参与生长抑制和细胞凋亡，其有效激活因素有温度、缺血缺氧等各种环境刺激[16]。ERK主要被生长因子、多肽类激素以及神经递质激活，控制细胞增殖、分化、生存和凋亡。本研究中，ERK-A基因的表达受低温诱导，可能与ERK、p38和JNK三条通路的相互作用有关[17,18]。

本研究从中华蜜蜂转录组数据中获得ERK-A基因的cDNA，该基因在低温条件下上调表达，说明在中华蜜蜂中ERK通路可能参与了低温下的信号转导。昆虫的一生会经常性受到来自环境的各种各样的刺激，昆虫的诱导表达适应机制提示人们，昆虫对环境的适应是一个能动的过程。昆虫通过启动与抗低温有关的基因并使之表达，给出逆境保护措施，从而协助昆虫度过难关或逆境。因此，研究与冷应激密切相关的基因，探讨如何迅速诱导昆虫冷适应机制的高效运作，提高昆虫在不利环境下的存活率，将是现在乃至将来昆虫学家应倾力研究的课题。此外，不同类型的应激可以诱导不同的应激蛋白，后者即可用来判断昆虫受到何种应激和应激的程度。研究冷应激过程中发生改变的这些蛋白用以衡量应激的程度，作为指导我们工作和生产的一个标准。因此，从分子水平上研究冷应激的分子机制，将具有极大的基础研究和实践应用价值，研究MAPK信号通路对低温胁迫的调控，有助于全面了解昆虫的耐寒机制。

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