人前列腺癌组织Krüppel-like factor 4（KLF4）和E-cadherin蛋白的表达及其与危险因素等级间的关系*

张 能 苏 鹏 崔 伟 黄 翔 李晓光 罗 旭

遵义医学院附属医院泌尿外科（贵州遵义 563003）

局限性前列腺癌行根治术后5年存活率可高达99%，但发生远处转移的患者5年生存率仅28%[1]。PSA、Gleason分级和临床分期是前列腺癌危险因素分级的三个关键因素，随危险因素等级升高患者预后越差。因此，对危险因素相关的蛋白标记物深入研究有重要的临床价值。转录因子KLF4属于组织依赖型基因，既可以作为肿瘤抑制基因也可以扮演癌基因[2,3]。KLF4在胃癌[4]、前列腺癌[5]表达量显著降低或缺失。恢复KLF4后能降低前列腺癌细胞活性和生长速度、克隆形成、迁移和侵袭，其低表达是前列腺癌预后不良的重要指标[5]。E-cadherin最重要的生理作用是介导同型上皮细胞黏附和维持组织正常形态结构，E-cadherin表达下降时细胞间黏附力减低，当肿瘤细胞一旦获得转移的必要条件时即发生转移[6]。高侵袭乳腺癌的研究表明E-cadheirn是KLF4的关键靶基因，KLF4诱导E-cadherin表达阻滞上皮间质转化（EMT）而抑制肿瘤转移[7]。本文通过检测人前列腺癌组织中KLF4和E-cadherin蛋白的表达水平，探讨其与前列腺癌危险因素等级间的关系及临床意义。

材料和方法

一、临床资料

回顾性检测分析2015年1月至2017年1月我院泌尿外科手术切除的临床及病理资料完整的前列腺癌标本，共56例。所有病例术前未进行放疗及内分泌治疗，术后病理诊断为前列腺癌。年龄50～67岁（平均64.3岁）；术前PSA分布情况：＜10mg/L 9例，10～20mg/L 26例，＞20mg/L 21例；术前穿刺活检Gleason评分情况：≤6分6例，7分33例，≥8分17例；临床分期：≤T2a 9例，T2b 19例，≥T2c 28例。选取同期行TURP的56例BPH患者前列腺组织作对照。

二、方法

KLF4兔抗人多克隆抗体（ab26648）购于英国Abcam公司，E-cadherin（ab6528）鼠抗人单克隆抗体购于Santa Cruz生物有限公司；SP试剂盒及DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。使用免疫组化SP两步法检测KLF4和E-cadherin蛋白的表达。根据厂家提供的试剂盒说明书完成具体实验步骤：组织标本制作成5μm厚切片，检测前常规脱蜡水化，经微波修复抗原后使用过氧化酶灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次后山羊血清封闭。滴加一抗（KLF4 1:100 ，E-cadherin 1:100），4℃冰箱过夜，PBS反复冲洗3次后滴加二抗37℃孵育30 min，DAB显色蒸馏水终止反应，经苏木精复染后，树脂封片后显微镜下观察。阴性一抗对照用PBS缓冲液代替，以检测细胞出现棕黄色颗粒为阳性细胞，以染色细胞＞10%为阳性表达；染色细胞＜10%为阴性表达。BPH组织中KLF4蛋白主要在细胞浆表达，少部分细胞胞核呈阳性反应，而前列腺癌组织中胞浆表达量明显减少或者只有胞核表达。E-cadherin蛋白在前列腺癌细胞膜表达明显减少，细胞质出现阳性异常染色或以细胞质为主的染色。

三、统计学处理

对所有统计资料都采用SPSS19.0软件包进行统计分析，两组间阳性率的检验应用x2检验完成，各危险因素指标间两种蛋白阳性率差异性比较采用行×列表x2检验，检验水准为P＜0.05；KLF4与E-cadherin蛋白表达（交叉频数）相关性采用Spearman相关分析。

结 果

《中国泌尿外科疾病诊断治疗指南》（2014年版）中，根据PSA、Gleason分值及临床分期3项综合指标将前列腺癌危险度分为低危、中危及高危3个等级[8]。本研究检测前列腺癌中KLF4与E-cadherin 蛋白的表达水平，研究它们与前列腺癌不同危险因素等级相应指标间关系。

一、KLF4和E-cadherin蛋白在人前列腺癌和BPH组织的表达

本研究中前列腺癌组织的KLF4蛋白阳性表达率为12.5%（7/56），明显低于BPH组织中表达率75%（42/56），两者间差异有统计学意义（x2=44.44，P = 0.000）；E-cadherin蛋白在前列腺癌组织中阳性表达率为32.1%（18/56），明显低于BPH组织中的表达87.5% （49/56），两者间差异有统计学意义（x2=35.70，P = 0.000），见表1和图1。

二、前列腺癌组织中KLF4，E-cadherin的表达的相关性

根据KLF4及E-cadherin在前列腺癌组织中表达的分布情况，统计学结果显示KLF4与E-cadherin表达呈正相关，r =0.527，P＜0.05，见表2。

三、前列腺癌组织中KLF4与E-cadherin蛋白及其与危险级别参数间的关系

56例前列腺癌组织中KLF4蛋白和E-cadherin蛋白呈阳性表达分别为7例及18例。其中KLF4和E-cadherin阳性表达数量在不同PSA分级中的分布情况分别是：＜10mg/L 3例、6例，10～20mg/L 4例、8例，＞20mg/L 0例、4例。KLF4及E-cadherin在不同PSA分级中表达结果显示两者与PSA分级有统计学差异（x2分别是6.713，6.592；P分别是0.026，0.037）。KLF4和E-cadherin阳性表达数量在不同Gleason分级中的分布情况分别是：≤6分 2例、12例，7分 4例、5例，≥8分 1例、1例。KLF4及在不同Gleason分级中进行统计学分析，结果显示KLF4蛋白与Gleason分级无统计学差异（x2=0.530，P=1），但E-cadherin蛋白表达与Gleason分级有统计学差异x2=15.453，P=0.000）。KLF4、E-cadherin阳性表达数量在不同临床分期中的分布情况分别是：≤ T2a期 5例、12例，T2b期2例、5例，≥T2c期0例、2例，KLF4及E-cadherin在不同临床分期中进行统计学分析，结果显示均有统计学差异（x2分别是8.936，16.598；P分别是0.007，0.000）（见表3）。

图1 人前列腺癌和BPH组织中KLF4和E-cadherin蛋白的表达（SP法，×400）

表1 KLF4和E-cadherin在前列腺癌组织中及BPH中的表达

表2 前列腺癌中KLF4和E-cadherin蛋白表达的相关性

表3 KLF4与E-cadherin蛋白在前列腺癌各危险因素中的表达情况及相关性

讨 论

前列腺癌是发达国家男性最常见的恶性肿瘤，来自美国癌症协会数据显示前列腺癌的死亡率仅次于肺癌，成为第二位致死性恶性肿瘤[9]。前列腺癌的治疗包括根治性切除术、放疗、化疗及去势术，为了更好的选择治疗方案及对预后进行判断，术前根据血清PSA 、Gleason 评分和临床分期将前列腺癌分为低、中、高危三个等级。随着前列腺癌危险因素等级升高患者预后越差，对危险因素相关的基因蛋白深入研究对提高前列腺癌的早期诊断和预后判断非常必要。

生理状态下KLF4对皮肤屏障形成、维持胃肠道上皮稳态以及胃肠道上皮细胞增殖与分化[10]等方面发挥重要的作用，若敲除胃肠道上皮细胞内的KLF4后，上皮表现为异常增殖、分化改变及易受射线伤害[11]。有研究证明转录因子KLF4参与肿瘤干细胞的维持而与造成肿瘤细胞增殖、分化、侵袭及转移等恶性生物学行为相关[12,13]，KLF4属于组织依赖型基因，既可抑制肿瘤生长也可以扮演癌基因[2,3]，在消化道肿瘤及前列腺癌中KLF4属于抑癌基因[4,5]，并且KLF4是前列腺癌预后不良的标志物之一。本报道结果显示56例前列腺癌中仅7例（12.5%，7/56）KLF4蛋白表达阳性，与相同BPH组织（75%，42/56）相比两者间存在差异。KLF4在不同危险因素中的分布情况显示，KLF4阳性表达数量在不同PSA分级中的分布情况分别是：＜10mg/L 3例，10～20mg/L 4例，＞20mg/L 0例，KLF4在不同PSA分级中进行比较，结果表明有统计学差异（x2=6.713，P= 0.026）。这一结果目前尚未见相关文献报道，但两者各自表达变化的精确程度、可能机制及相关性研究需更大数量的病例及细胞变化内进一步验证。KLF4表达水平与Gleason分值间无统计学意义（x2=0.530，P=1）；KLF4对临床分期这一危险因素的预测价值，免疫组织化学（IHC）检测结果显示KLF4阳性表达数量在≤T2a期、T2b期及≥T2c期分别是5例、2例及0例，统计学结果显示不同临床分期中KLF4表达率有统计学差异（x2=8.936，P= 0.007）。这表明随着临床分期越晚KLF4蛋白表达越低，结合PSA及临床分期情况提示KLF4是前列腺癌预后重要的预测指标。

E-cadherin蛋白主要表达于上皮细胞内，介导同型细胞黏附及维持组织的形态。上皮来源的恶性肿瘤中E-cadherin都呈低表达，与肿瘤细胞发生远处转移密切相关；分子机制显示E-Cadherin表达减少参与了上皮间质转化（EMT）是诱导肿瘤转移最关键步骤[14]。侯铸等[15]发现前列腺癌中E-cadherin表达减少。E-cadherin在BPH组织上皮呈强阳性表达，前列腺癌组织表达明显减弱，本实验显示18例前列腺癌组织中E-cadherin蛋白表达呈阳性（18/56，32.1%），与BPH组织（87.5%，49/56）相比两者间存在差异（x2=35.70，P= 0.000）。在不同危险因素中的分布情况显示，E-cadherin阳性表达数量在不同PSA分级中的分布情况分别是：＜10mg/L 6例，10～20mg/L 8例，＞20mg/L 4例，E-cadherin在不同PSA分级中进行统计学分析，结果有统计学差异（x2=6.592，P=0.037）；Gleason分级中结果显示≤6分、7分及≥8分 E-cadherin表达阳性分别为12例、5例及1例，随着Gleason分值增加E-cadherin蛋白的表达逐渐降低，并且差异具有统计学意义（x2=15.453，P=0.000）。前列腺癌Gleason分级越高细胞形态学异型性不断升高甚至出现坏死组织结构，前列腺组织失去正常上皮结构；E-cadherin是上皮表型最重要的标志物，它随着上皮细胞减少而呈低表达状态，因此随着Gleason分级越高E-cadherin表达越低。不同Gleason分级间E-cadherin表达异常有统计学意义，结合IHC显示E-cadherin阳性表达数量在≤T2a期、T2b期及≥T2c期分别是10例、6例及2例，不同临床分期中有统计学差异（x2=16.598，P=0.000）。本次检测的E-cadhein蛋白表达与前列腺癌组织分化程度及临床分期间的关系和既往研究结果一致[15]。上述结果表明KLF4及E-cadherin蛋白随着前列腺癌组织分级降低、肿瘤浸润深度加深而降低，这一结果提示两种蛋白表达减少或者缺失与前列腺癌危险因素分级密切相关，是前列腺癌除PSA、Gleason分级及临床分期等公认的危险因素之外的重要分子标志物，他们的异常表达亦能判定前列腺癌的临床进展及预后。

本实验发现前列腺癌组织中KLF4和E-cadherin的表达呈正相关（r =0.527，P＜0.05），提示KLF4和E-cadherin蛋白表达降低在前列腺癌分级中相互促进，它们在前列腺癌中的相互作用很可能同乳腺癌的侵袭转移一样，由于E-cadherin的减少引起KLF4表达降低，从而导致癌细胞浸润和转移能力增强[7]。前列腺癌的侵袭转移与上皮-间质转化（EMT）有着密切的关系，而EMT最重要的标志是E-cadherin蛋白表达量减少或者缺失。前列腺癌组织中E-cadherin、KLF4蛋白低表达在前列腺癌进展过程中发挥重要作用，联合检测E-cadherin和KLF4蛋白可以更有效的判断前列腺癌侵袭转移生物学特性。现在推测可能的机制是E-cadherin蛋白的减少引起KLF4表达降低，从而导致癌细胞浸润甚至发生转移的能力增强，在前列腺癌中KLF4和E-cadherin变化及可能机制需在分子水平及体内实验进一步证实。

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