纤维素降解菌复合菌系的构建及产酶研究

雷湘兰 孙倩 沈振国 唐滇

摘 要：本研究利用从红树林土壤中分离、筛选得到椰糠纤维素高效降解菌，通过菌株间拮抗研究和滤纸条降解研究，构建和筛选出具有高效降解椰糠纤维素能力的优选复合菌系，通过对优选复合菌系的产酶条件的研究，确认了其产酶的最佳条件。结果表明：优选复合菌系Z-10 / B-05的纤维素降解能力优于单一菌株，其产酶最佳条件是：培养温度35℃，培养液初始pH值6.5，培养时间5d。在优选产酶条件下，复合菌系Z-10 / B-05对椰糠、秸秆均有较好的降解效果，椰糠降解率达到36.1%。

关键词：纤维素降解；复合菌系；产酶条件

中图分类号：Q539+3 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180329003

纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，也是一种可再生有机资源，但秸秆、椰糠等纤维素类物质较难被分解，常被焚烧或废弃，既污染生态环境，又浪费资源。因此，提高对纤维素类物质的利用，筛选建立高效降解纤维素的菌株和菌系，具有重要意义[1-4]。

本研究利用从红树林中分离、筛选出的具有高效降解椰糠纤维素能力的菌株，构建了复合菌系Z-10 / B-05。通过对优选复合菌系产酶条件及对不同类别纤维素发酵效果的初步研究，为纤维素的资源化利用提供菌种资源和开发参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试剂：磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵、羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

菌种：细菌B-05、B-09、B-13；霉菌Z-10、Z-14、Z-20，均为从红树林中分离、筛选出的具有高效降解纤维素能力的菌株，由海南职业技术学院热带农业技术学院实验室保藏。

培养基：羧甲基纤维素钠培养基：CMC-Na 15.0g，磷酸二氢钾1.5g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.3g，蛋白胨10.0g，蒸馏水1000 mL，琼脂18.0g，pH 6.8。

滤纸条培养基：硫酸铵1.0g，酵母粉0.1g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.3g，磷酸氢二钾2.0g，滤纸条（1cm×6cm），蒸馏水1000 mL。

发酵培养基：椰糠粉10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.2g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，蒸馏水1000 mL，pH 6.8。

椰糠液体培养基：椰糠粉5g，氯化钠5.0g，硫酸镁0.1g，磷酸二氢钾1.0g，葡萄糖1.0g，硫酸铵2.0g，蒸馏水1000 mL，pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 拮抗实验

按参照文献[5]的实验方法。

1.2.2 复合菌系构建方法

将菌株按细菌霉菌两两组合，分别接种到装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，110 r/min，35℃±1℃恒温培养14d，观察滤纸条降解情况。

1.2.3 产酶活性研究

纤维素酶活力（ CMC 酶活）测定参照文献[6]实验方法

1.2.4 复合菌系产酶条件研究

1.2.4.1 培养温度的影响

将复合菌系接种到装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下，110 r/min，培养5d后，取样测定其纤维素酶活力（ CMC 酶活）。

1.2.4.2 起始pH的影响

将复合菌系分别接种到起始pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的裝有00mL发酵培养基的250mL三角瓶中。110 r/min，35℃±1℃，培养5d后，取样测定其纤维素酶活力（ CMC 酶活）。

1.2.4.3 培养时间的影响

将复合菌系接种到装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，35℃±1℃，110 r/min，培养7d，每24h取样测定其纤维素酶活力（ CMC 酶活）。

1.2.5 复合菌系发酵实验

使用椰糠液体培养基时，分别用玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆替代椰糠，作为碳源。将优选复合菌系接种到液体培养基，保持条件不变，在35℃±1℃、发酵6d，研究优选复合菌系对其降解效果。

2 结果与分析

2.1 复合菌系的构建结果

2.1.1 菌株间拮抗研究

拮抗试验结果显示，两两组合的菌株未发现显著拮抗作用。

2.1.2 维素降解复合菌系的构建

将细菌B-05、B-09、B-13与霉菌Z-10、Z-14、Z-20，分别混合发酵，构建纤维素降解菌系。由表1结果可知：霉菌Z-10和B-05在降解纤维素方面存在比较明显的协同作用，菌株Z14、Z-20与B-09、B-13虽无明显拮抗，但对滤纸的降解效果不理想。菌系Z-10 + B-05组合对滤纸的降解效果最优，具有良好的应用潜力，作为优选复合菌系。

2.2 复合菌系产酶条件研究

2.2.1 培养温度的影响

图1显示，当温度为35℃时，优选复合菌系的酶活力大最大73.9 U/mL。超过40℃后，优选复合菌系的产酶能力下降显著。当温度在35℃之前时，则优选复合菌系的酶活随温度的升高而增大。

2.2.2 起始pH的影响

图2显示，pH6.5，优选复合菌系产生的酶活最高，CMC为79.7 U/mL。优选复合菌系在中性和弱酸性条件下均表现出较好的酶活性。在碱性条件下，其酶活呈明显下降趋势。

2.2.3 培养时间的影响

图3显示，发酵培养2～7d时，优选复合菌系产酶处于较高水平。5d时，酶活达到最大值83.7U/mL。超过6d，酶活力逐渐下降。

2.3 纤维素降解菌复合菌系发酵实验

优选复合菌系对不同类别纤维素发酵6d时的降解率见表2。

表2显示，优选复合菌系对椰糠、秸秆类纤维素具有高效降解作用。其中，对椰糠的降解转化率最高，降解率达到36.1% 。

3 结语

本研究构建的高效降解纤维素的最优复合菌系Z-10 + B-05，其产酶最佳条件：培养温度35℃，培养液初始pH值6.5，培养时间5d。在该优化条件下，优选复合菌系对椰糠、秸秆类纤维素，表现出较高的降解能力，具有的应用潜力，并为下一步研究提供了菌种资源和基础资料。

优选复合菌系产生的纤维素降解酶系及作用机制等尚完全明确，有待进一步研究和探讨。

参考文献

[1]何隽菁.纤维素酶的研究应用新进展[J].科技资讯，2006（32）：7.

[2]赵琪，李亚兰，陈子欣，等.纤维素酶应用研究的最新进展[J].广州化工，2014（6）：21-23.

[3]范力敏，季萍，陈晓湘，等.转化纤维素资源生成酒精的研究 [J].环境科学学报，1990，10（3）：356-358.

作者简介：雷湘兰（1980-），女，讲师，硕士，研究方向：食品微生物、食品加工；沈振国（1982-），男，讲师，硕士，研究方向：应用生物技术。