成年似鲇高原鳅外周血细胞及血细胞发生的观察

赵柳兰，代 敏，杨 淞，吴应斌，汤巨平，杨世勇，杜宗君

(1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.四川省似鲇高原鳅省级原种场，四川峨眉山 614224)

似鲇高原鳅 (Triplophysasiluroides)属鲤形目(Cypriniformes)鳅科(Cobitidate)条鳅亚科(Nemachilinae)高原鳅属(Triplophysa)，是中国特有的冷水性鱼类，能够适应于青藏高原特殊的高寒环境，为鳅科中最大的一种，主要分布于四川、甘肃、青海的黄河干支流及附属湖泊[1]。似鲇高原鳅肉质鲜美，具有较高经济价值，由于环境变化、分布的局限性及生长慢等原因，几乎濒临灭绝。似鲇高原鳅对高原环境有着极强的适应性，而如今却很难养殖，这与其免疫适应性的机制密切相关。到目前为止，似鲇高原鳅的研究较少，如遗传多样性[1]、呼吸耗氧[2]及苗种培育[3]等方面的初步研究，而免疫学方面仅见皮肤和鳃粘膜免疫结构[4]及部分细菌性病原的分离[5]，其他方面几近空白。血细胞是细胞免疫的基础，承担着免疫应答的重要机能，并且能够随外界环境因素的影响而发生变化，反映机体的健康和所处环境状况，也能够为其疾病防治提供重要依据[5,6]。本研究通过对似鲇高原鳅的外周血细胞、中肾、肝脏和脾脏的血细胞发生进行研究，以期为揭示似鲇高原鳅免疫适应性原因及今后该种类的合理保护和养殖开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验用鱼

似鲇高原鳅源自眉山似鲇高原鳅原种场，充氧后运回实验室，暂养于水族箱内，24 h不间断充氧，水温13 ℃左右，选取体色正常、反应灵敏的10尾个体(雌雄比1∶1)进行取样，平均体重为(93.12±12.73)g，平均体长为(22.08±1.91)cm。

1.2 实验方法

采血制作血涂片和取中肾、肝脏、脾脏组织制作印片并染色。

1.2.1 制片

血涂片的制备：用MS-222将鱼体麻醉，注射器尾静脉采血，制作血涂片。用生理盐水将血液稀释200倍后，在Neubauer计数板上完成血细胞计数。每尾鱼制作15张血涂片，室温晾干。

组织印片的制备：解剖似鲇高原鳅，取出中肾、肝脏及脾脏组织，生理盐水冲洗并用吸水纸吸干，横切，制取印片。每尾鱼每种组织制作15张印片，室温晾干。

1.2.2 细胞形态观察与计数

制作好的血涂片和组织印片用新配的2.5%戊二醛固定，Wright’s染色，中性树胶封片，在Olympus100倍镜下观察并拍照。每张涂片和印片随机选取10个视野，进行血细胞分类、计数。各种细胞均选取30个，用Image-Pro Plus 6.0软件进行细胞和细胞核大小(长径×短径)测定，结果用平均值±标准差(Mean ± SD)表示。

每张组织印片上随机取10个视野，对其中的各类细胞都分为原始型、幼稚型及成熟型进行统计，各类细胞均统计，总计5 000个，分别计算其所占的百分比，并测量印片上细胞的大小，不同类型细胞分别测量200个，用Image-Pro Plus 6.0软件分析，其细胞大小用平均值 ± 标准差(Mean ± SD)表示。

1.2.3 细胞化学特性的观察

血涂片的化学染色参照Shigdar等[6]的方法。

过碘酸雪夫染色(periodic-acid schiff，PAS)主要着染糖原，阴性对照采用唾液淀粉酶消化处理，阳性反应多糖部分被染成红色。

苏丹黑B(sudan black B，SBB)主要着染脂肪，阴性对照用丙酮处理，阳性反应有黑斑出现，表示有脂类物质存在。

1.2.4 细胞类型及发育阶段的判定

细胞形态、类型和发育阶段的判定参照Fijan[7]的标准。

2 结果

2.1 似鲇高原鳅血细胞的比例及大小

在外周血涂片中可见成熟的红细胞、粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及血栓细胞，少见晚幼红细胞，偶见无法辨别的细胞(约占白细胞中的比例为0.21%)；外周血细胞研究发现似鲇高原鳅总血细胞数(THC)为1.39×1012个/L，红细胞占97.56%，白细胞占2.44%。外周血中各种白细胞细胞比例血栓细胞为最大，为52.86%，三种粒细胞中嗜中性粒细胞数量最多占30.25%，具体见表1。而在肝脏、中肾和脾脏中可见不同发生阶段的红细胞系、粒细胞系、淋巴细胞系和单核细胞系。在以上组织中，红细胞系在脾脏中所占比例最大，粒细胞在中肾中所占比例最大，其次是脾脏，肝脏中未见原始型血细胞，具体见表1。似鲇高原鳅外周血及组织中血细胞大小见表2。

2.2 似鲇高原鳅血细胞的形态特征

2.2.1 红细胞系各阶段细胞形态特征

原红细胞(proerythroblast，PEB)：圆形或椭圆形，偶有钝的伪足，细胞质较少且不均匀，被染成深蓝色。胞核为圆形，占细胞绝大部分，中位，偶有偏位，周围有一圈浅染环带区，深紫红色的染色质呈网状，核仁为蓝色，但边界不明显，较平坦或有凹陷感。(图版Ⅱ-1)

表1 似鲇高原鳅外周血及组织中各种血细胞的比例Tab.1 Percentage of various blood cells in the peripheral blood and tissues of T.siluroides

注：外周血一栏中血细胞均为成熟的血细胞，且嗜中性、嗜碱性 、嗜酸性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞比例为占白细胞中的比例

表2 似鲇高原鳅外周血及组织中血细胞及其核的大小(平均值 ± 标准差)Tab.2 Cell and nucleus sizes of various haematopoietic cells in the peripheral blood and tissues in T.siluroides(Mean ± SD) /μm

续表2

早幼红细胞(basophilic erythrocyte，BEB)：胞体和胞核均稍小于原红细胞，胞质为蓝色或灰蓝色。胞核为圆形，仍占细胞绝大部分，中位或稍偏，浅染的环带区依旧存在，紫红色染色质逐渐聚集，形成更粗糙的网状结构，核仁小且逐渐消失。(图版Ⅱ-2)

晚幼红细胞(orthochromic erythroblast，OEB)：圆形，胞质由灰蓝色逐渐变为桔黄色或砖红色。胞核为圆形，此时缩小，稍偏一侧，染色质固缩成块状，间隙模糊不清。(图版Ⅱ-3)

红细胞(erythrocyte，E)：成熟的红细胞为椭圆形或长椭圆形，表面光滑，胞质为砖红色。胞核多为椭圆形偶有圆形，中位，浓密的染色质染成深紫红色，无核仁，偶尔可见正处于分裂状态的红细胞。(图版Ⅰ-1～3；图版Ⅱ-4～8)

2.2.2 粒细胞系各阶段细胞形态特征

原粒细胞(granuloblast，GB)：圆形或椭圆形，与原红细胞相似，常有钝的伪足，胞质少且不含颗粒，染成蓝色。胞核圆形或椭圆形，位置居中或稍偏，细沙状的染色质分布均匀，核仁外凸，边界明显。(图版Ⅱ-9)

粒细胞的发育阶段可分为早幼、中幼、晚幼、成熟粒细胞(图版Ⅱ-10～19)，具体如下：

早幼粒细胞(young netrophilic progranulocyte，YPG)：圆形或椭圆形，胞质稍多，淡蓝色，有浅紫红色的嗜天青颗粒出现，由早期至晚期逐渐增多，颗粒大小不一。胞核为圆形或椭圆形，偏位，核质比大于二分之一，染色质逐渐由细沙状变为粗砂状，核仁不清晰。(图版Ⅱ-10)

中幼粒细胞(progranulocyte，PG)：圆形或椭圆形，浅蓝色的胞质更为丰富，胞质中的特殊颗粒因化学性质不同而呈现不同的颜色，被染成浅粉色的是嗜中性中幼粒细胞(neutrophilic progranulocyte，NPG)(图版Ⅱ-11)，覆盖着深蓝色颗粒的是嗜碱性中幼粒细胞(basophilic progranulocyte，BPG)(图版Ⅱ-14)，染成红色的是嗜酸性中幼粒细胞(eosinoopilc progranulocyte，EPG)(图版Ⅱ-17)。胞核为椭圆形，偏位，核质比约为二分之一，核仁完全消失。

图版Ⅰ 似鲇高原鳅外周血细胞Plate Ⅰ Peripheral blood cells of T.siluroides

1.E.成熟红细胞；2.DE.正在分裂的红细胞；3.OEB.晚幼红细胞；4.NG.嗜中性粒细胞；5.BG.嗜碱性粒细胞；6.EG.嗜酸性粒细胞；7.M.单核细胞；8.LL.大淋巴细胞；9.SL.小淋巴细胞；10.TH.血栓细胞；11.TH.聚集成群的血栓细胞；12.A.未知细胞；标尺 = 10 μm。

晚幼粒细胞(metagranulocyte，MG)：圆形或椭圆形，胞质丰富，浅蓝色，依据特殊颗粒的颜色可分为嗜中性晚幼粒细胞(图版Ⅱ-12)、嗜碱性晚幼粒细胞(图版Ⅱ-15)和嗜酸性晚幼粒细胞(图版Ⅱ-18)。胞核固缩成椭圆形、肾形或马蹄形等不规则形状，位置偏于细胞一侧，染色质聚集成块状。

嗜中性粒细胞(neutrophilic granulocyte，NG)：细胞呈圆形，胞质内充满细小的无色中性颗粒。胞核形态多样，为不规则的圆形、杆状或分叶状，偏于细胞一侧。(图版Ⅰ-4；图版Ⅱ-13)

嗜碱性粒细胞(basophilic granulocyte，BG)：细胞多为圆形，胞质呈浅蓝色，有大小不一的嗜碱性颗粒。胞核为扁椭圆形、杆状或分叶状，偏位，染色质致密。(图版Ⅰ-5；图Ⅱ-16)

嗜酸性粒细胞(eosinoopilc granulocyte，EG)：细胞呈圆形或椭圆形，胞质为淡橘红色，有细小的橘红色颗粒。胞核形态多样，有肾形、长椭圆形和分叶形，常偏于细胞一侧。(图版Ⅰ-6；图版Ⅱ-19)

2.2.3 单核细胞系各阶段细胞形态特征

原单核细胞(monoblast，MB)：圆形或不规则形，体积是三系白细胞中最大的，胞质灰蓝色或浅蓝色，不发亮呈网状，常有伪钝足，偶有空泡出现。胞核形状多样，常扭曲、折叠成不规则形状，分布有不均匀的紫红色纤细染色质，核仁清晰。(图版Ⅱ-20)

幼单核细胞(promonocyte，PM)：圆形或椭圆形，体积稍小于原单核细胞，胞质增多，为灰蓝色，常出现伪足或副浆，网状，少有空泡，出现少量细小的紫红色的嗜天青颗粒。胞核形状不规则，常扭曲、折叠或分叶，染色质开始聚集成网状，但仍较纤细，核仁不明显。(图版Ⅱ-21)

单核细胞(Monocyte，M)：细胞呈圆形，体积稍小，胞质为灰蓝色，多有空泡和细小颗粒。细胞核不规则，折叠、扭曲或分叶，可呈马蹄形或大肠状，核质比较大，染色质凝集呈粗网状。(图版Ⅰ-7；图版Ⅱ-22)

2.2.4淋巴细胞系各阶段细胞形态特征

原淋巴细胞(lymphoblast，LB)：圆形，表面不光滑，有伪足伸出，胞质很少，为深蓝色，近核处有一浅染的环带区，核周界明显。胞核形状多样，有圆形或肾形，几乎占据整个细胞，居中或略偏一旁，染色质是三系细胞中最粗糙的，呈粗网状，核仁清晰 ，有凹陷感。(图版Ⅱ-23)

幼淋巴细胞(prolymphocyte，PL)：圆形或椭圆形，有伪足，胞质稍多，深蓝色，有嗜天青颗粒出现。胞核为圆形或偶有凹陷，染色质粗糙且紧密，染成紫红色，核仁逐渐消失。(图版Ⅱ-24)

淋巴细胞(lymphocyte，L)：细胞呈圆形，胞体表面凹凸不平，胞质为淡蓝色，有少许嗜天青颗粒。核多不规则，几乎占据整个细胞，染色致密。(图版Ⅰ-8，9；图版Ⅱ-25)

2.2.5 血栓细胞

血栓细胞(Thrombocyte，TH)：细胞呈椭圆形、纺锤形或不规则形，个体较小，细胞核大，有时几乎看不到胞质，像一个裸露的细胞核，通常聚集成群。(图版Ⅰ-10，11；图版Ⅱ-26)

2.3 似鲇高原鳅血细胞的化学特征

对似鲇高原鳅外周血细胞和组织进行化学染色，结果见图版Ⅲ。结果表明过碘酸雪夫(PAS)染色显示，红细胞均为阴性；所有白细胞的胞质均染成红色，为阳性。但不同种类的白细胞着色程度有所区别，淋巴细胞和血栓细胞都呈深红色，呈强烈阳性；单核细胞和嗜碱性粒细胞次之；嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞着色较浅，呈弱阳性。苏丹黑B(SBB)染色结果显示嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞呈棕黑色，显阳性，但颜色的深浅根据细胞的成熟度逐渐增加。红细胞和血栓细胞均呈阴性。(图版Ⅲ)

3 讨论

3.1 血细胞发生场所

对于血细胞发生场所的研究，不同的鱼类结果有所差异。如长鳍裸颊鲷(Lethrinuserythropterus)[8]、暗纹东方鲀(Takifuguobscurus)[9]和美国红鱼(Sciaenopsocellatus)[10]血细胞的主要发生场所在头肾和中肾；而齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)[11]、日本黄姑鱼(Nibeajaponica)[12]、军曹鱼(Rachycentroncanadum)[13]等大多数鱼类血细胞发生的主要场所除头肾和中肾外还有脾脏。金丽[14]通过对长吻鮠(Leioeasislongirostris)肝脏组织印片的研究，没有观察到原始型血细胞，认为其可能不是造血器官；长鳍裸颊鲷[8]和泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)[15]的情况与之相似。由此可见，大多数鱼类血细胞发生场所主要由头肾、中肾和脾脏组成。本研究发现成年似鲇高原鳅肾脏是粒细胞和淋巴细胞的主要发生场所，脾脏中可见较多的原始单核细胞，肝脏中未见原始型血细胞，可能不是成年似鲇高原鳅的造血器官。岳兴建[16]认为硬骨鱼类头肾和肾脏的形态类型多样，本课题组经过大量的解剖实验，发现成年似鲇高原鳅头肾几乎未见，至于头肾是否为其主要的造血器官还有待进一步研究。

3.2 血细胞发育的规律

血细胞的发育规律通常可分为原始、幼稚和成熟三个阶段。

似鲇高原鳅红细胞的发育过程从原红细胞经幼红细胞再到成熟红细胞，胞体形态由圆形变为椭圆形，体积先由大变小，再由小变大，胞质由少变多，颜色由深蓝逐渐变浅，直至粉红色，胞核由大到小，染色质逐渐固缩成块。完成功能后的红细胞直接分裂，产生两个衰老的红细胞或一个衰老的红细胞和一个红细胞胞质小体，这与日本黄姑鱼[12]、长吻鮠[14]和大弹涂鱼[17]等研究类似。

似鲇高原鳅粒细胞的发育可分为原始粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞和成熟粒细胞五个阶段，除原始和早幼阶段，又根据胞质内的特殊颗粒将之分为中性、酸性和碱性[18]。粒细胞的发育过程中，胞体由大变小，胞核由圆形变为椭圆形、肾形、杆状或分叶型，核质比由大逐渐变小，这与日本黄姑鱼[12]、长吻鮠[14]和大弹涂鱼(Boleophthalmuspectinirostris)[17]的变化过程相同。不同鱼类的三种粒细胞存在情况是有差异的，如长吻鮠[14]、泥鳅[15]血细胞中未见嗜碱性粒细胞，军曹鱼[13]未见嗜酸性粒细胞，齐口裂腹鱼[11,19]外周血中两者均未见到。本研究发现似鲇高原鳅存在三种粒细胞，大量嗜中性粒细胞和少量的各阶段的嗜碱性和嗜酸性粒细胞，这与日本黄姑鱼[12]一致。嗜中性粒细胞是最常见的粒细胞[20]，具趋化、吞噬作用及活跃的运动能力[6]，似鲇高原鳅外周血细胞中嗜中性粒细胞所占比率高达30.25%，这对似鲇高原鳅的免疫抗病能力具有重要作用。

3.3 其他细胞

在本研究中还发现了3个核的细胞(图版Ⅱ-27)和疑似吞噬细胞的细胞(图版Ⅱ-28)，与王凤计发现的人类白血病[21]中的幼稚淋巴细胞和吞噬细胞的形态一致，编者认为是由淋巴造血组织增生引起的。而目前研究比较多的是红细胞的核分裂及变形现象，认为是这种核的表面积增大，有利于核孔的物质核信息交流，或者是一种程序性衰老的现象[22]，似鲇高原鳅此类细胞的出现是否暗示着也具有淋巴细胞快速增生的能力或者是某种细胞衰老有待进一步研究。而在外周血的研究中偶见无法辨别的细胞，这种细胞比红细胞体积更大，细胞核染色质较疏松，但是数量极少，与金丽[14]描述的形态多样的核影细胞类似，并且在齐口裂腹鱼[11]、斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[7]等鱼中也出现类似细胞，推测可能与人为因素(如采血的方法、涂片的速度及抗凝剂有无等)或实验鱼个体生理状况不同有关[7,14]。

3.4 似鲇高原鳅外周血细胞与发生血细胞大小的比较及分析

本研究发现似鲇高原鳅外周血中的成熟的嗜中性粒细胞体积明显比组织中的小，类似现象在日本黄姑鱼[12]的嗜中性粒细胞，长鳍裸颊鲷[8]的血栓细胞上也有所体现。一般认为血细胞在造血器官或组织中产生，发育成熟或接近成熟时才释放到血液中。而同一类成熟的血细胞造血组织和外周血中的体积出现差异，本作者猜测可能与其具体的成熟程度相关，然而鱼类血细胞发育详细阶段的研究仍然未见。

本研究还对似鲇高原鳅的雌雄个体间血细胞形态及血液指标做了比较，没有差异故没有列出。最近对斗鱼(Bettasplendens)雌雄血细胞的研究也发现，不同性别鱼的血细胞形态及血液指标差异不显著[23]，在齐口裂腹鱼[19]、长薄鳅(Leptobotiaelongata)[24]等鱼中也存在这样的现象。

3.5似鲇高原鳅与部分鱼类外周血细胞化学染色的比较及分析

通过对似鲇高原鳅、贝氏高原鳅(T.bleekeri)[25]、长薄鳅[24]、黄石爬鮡(Euchiloglaniskishinouyei)[26]和齐口裂腹鱼[19]血细胞的化学染色情况对比分析。在似鲇高原鳅外周血中，所有种类的白细胞PAS染色均呈阳性，即均含糖类物质。这与同属于冷水鱼类的黄石爬鮡[26]的报道一致。随着细胞发育程度的加深，胞体颜色也逐渐加深，体现了似鲇高原鳅体内糖原的累积过程。通过SBB染色显示，除粒细胞、单核细胞和淋巴细胞呈阳性，其余细胞均为阴性。与同属冷水性鱼类的黄石爬鮡和齐口裂腹鱼都有相似之处，但与同属鳅科的贝氏高原鳅、长薄鳅不同。由此可以得出不同鱼类血细胞内脂质的有无与其生活的环境有密切关系。

图版Ⅱ 似鲇高原鳅组织中血细胞Plate Ⅱ Blood cells in tissues of T.siluroides

1.PEB.原红细胞；2.BEB.早幼红细胞；3.POE.中幼红细胞；4.OEB.晚幼红细胞；5.E.红细胞；6.E.衰老的红细胞；7.E.溶解的红细胞；8.DE.分裂的红细胞；9.GB.原粒细胞；10.YPG.早幼粒细胞；11.NPG.嗜中性中幼粒细胞；12.NMG.嗜中性晚幼粒细胞；13.NG.嗜中性粒细胞；14.BPG.嗜碱性中幼粒细胞；15.BMG.嗜碱性晚幼粒细胞；16.BG.嗜碱性粒细胞；17.EPG.嗜酸性中幼粒细胞；18.EMG.嗜酸性晚幼粒细胞；19.EG.嗜酸性粒细胞；20.MB.原单核细胞；21.PM.幼单核细胞；22.M.单核细胞；23.LB.原淋巴细胞；24.PL.幼淋巴细胞；25.L.淋巴细胞；26.TH.血栓细胞；27，28.A.B.未知细胞；标尺 = 10 μm

图版Ⅲ 似鲇高原鳅外周血和组织的 PAS 及 SBB 染色Plate Ⅲ Peripheral blood and tissue of blood cells imprint as revealed by PAS and SBB staining in T.siluroides1～13.PAS 染色；14～22.SBB 染色.1～5；15～17外周血涂片；6～14；18～22组织印片1,8，14,20.G.粒细胞；2,11，15,21.M.单核细胞；3,12，16，22.L.淋巴细胞；4,13.TH.血栓细胞；5,17.YPG.早幼粒细胞；6，18，PG.中幼粒细胞；7,19.MG.晚幼粒细胞；9.MB.原单核细胞；10.PM.幼单核细胞；标尺=10 μm

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