干细胞源性外泌体在心血管疾病中的研究进展

关梦珊 丘玉平 董凤英 李莹 谢志泉

1广东药科大学附属第一医院心血管内科（广州510030）；2广州中医药大学（广州510030）；3广州军区广州总医院干部病房四科（广州510030）

干细胞具有很高的自我更新能力和多种分化潜能，可用于治疗心血管疾病（Cardiovascular diseases，CVD）。然而仍存在着许多障碍，现有的干细胞修复受损组织的能力有限，并且它们在心脏中存活时间有限（仅几天）。VAN BERLO等[1]发现，在小鼠移植的心脏干细胞（Cardiac stem cells，CSCs）中仅有0.003%能够直接分化为新心肌细胞。最近的研究表明，多种干细胞的生物学特性并不依赖于它们自身的增殖，而是依赖于它们的内分泌和旁分泌活性物质。干细胞来源的外泌体可以直接与靶细胞膜融合，释放RNA进入细胞质，也可以通过识别并结合靶细胞表面的特异性受体来调节微环境并逆转疾病的发展。与其他细胞相比，干细胞具有通过核体途径产生外泌体的强大能力，并且外泌体能够模拟来源细胞的某些功能。CSCs和心脏祖细胞源性外泌体（CPC⁃derived exosomes，CPC⁃exo）具有与心脏细胞系统相似的遗传背景，这种相似性为降低免疫排斥反应提供了可能性[2]。此外，MSCs经过体外多代培养产生外泌体池，有趣的是，从培养的干细胞中除去外泌体可以显著削弱干细胞的保护作用[3⁃4]，从而表明外泌体是干细胞的关键活性成分。外泌体是干细胞分泌作用的典型代表，并在疾病治疗中广泛应用于细胞信号和生物学行为的调节。本文从生理和疾病两方面综述了干细胞源性外泌体在心血管系统中的研究现状。此外，本文还介绍了外泌体作为疾病生物标志物的应用，以及外泌体在生殖医学中的生物潜力。

1 外泌体的特性和功能

1.1 外泌体的结构细胞间相互作用方式不仅包括释放蛋白质、核酸、脂质和其它分子介导信号转导至细胞外受体，还包括通过囊泡将m RNA、mi RNA和蛋白质转移至受体细胞中。20世纪80年代，在绵羊的红细胞中首次发现细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）[5]，当时，分泌EVs被认为是一种细胞处理废物的方法。后来的研究表明，细胞外分泌是一种重要的细胞间交流方式，发生在许多生理和病理过程中，包括哺乳和免疫反应。外分泌过程还参与调节某些疾病，例如CVD、神经变性损伤和肿瘤。根据细胞来源和大小，EVs可分为3种类型：外泌体（直径范围为40～100 nm）、微泡（直径范围为100～1000 nm）和凋亡小体（直径范围为1 ～ 5 μm）[6⁃7]。

外泌体富含胆固醇和鞘磷脂，是定义明确的EVs，由溶菌酶颗粒倒置形成的多囊体与细胞膜融合后分泌到细胞外，即形成了外泌体。由于其特殊的结构，外泌体呈现高水平的细胞内内源性蛋白，与它的组织和细胞起源密切关联。这些蛋白包括整合素和四重跨膜蛋白家族（CD63、CD89、CD81、CD9和 CD82）、细胞内内源性蛋白 Alix和tsg101、热休克蛋白HSP70和HSP90、膜连接蛋白膜联蛋白和脂筏特征蛋白Floatilin等[8]。不同细胞来源的外泌体具有不同的蛋白质组成成分：肠上皮细胞来源的外泌体含有多种代谢酶和肠组织特异性A33抗原；B细胞来源的外泌体富含CD86和MHC分子；T细胞来源的外泌体具有促凋亡FASL受体。

除蛋白质外，外泌体还含有具有生物活性的遗传物质，包括信使RNA（m RNA）、微RNA（mi RNA）和小干扰RNA（si RNA）。在心肌细胞衍生的外泌体中，已经鉴定出1520种m RNA[9]，其中，发现mi RNA不仅是遗传信息的内源性调节因子，而且是调节细胞间通讯的生物标记物。外泌体和靶细胞之间的相互作用是非常特异的，例如，血小板衍生的外泌体靶向作用于内皮细胞和巨噬细胞，而中性粒细胞衍生的外体靶向作用于血小板、巨噬细胞和树突细胞[10]。外泌体靶向作用分3种类型：（1）外泌体直接与靶细胞膜融合，然后直接将m RNA、mi RNA和si RNA释放到细胞质中；（2）外泌体通过胞吞作用被靶细胞摄取；（3）外泌体辨别并结合靶细胞表面上的特异性受体。外泌体表面存在多种生长因子和细胞因子，其中大多数含有活性脂质成分，包括鞘氨醇⁃1⁃磷酸（S1P）和神经酰胺⁃1⁃磷酸（C1P），当外泌体进入靶细胞时，这些因子可抑制细胞凋亡和刺激血管生成[11]，同时，也将外泌体所含的mi RNA转移到了受体细胞。在这个过程中，既传递了遗传信息同时又调节细胞功能。例如，活化的巨噬细胞通过增加外泌体中mi RNA⁃150的含量，从而抑制mi RNA⁃150靶基因c⁃Myb在内皮细胞中的翻译来刺激内皮细胞迁移[12]。

1.2 干细胞源性外泌体与心血管疾病动脉粥样硬化斑块中，微钙化是指通过传统成像方法检测到的钙化，其存在于易损斑块的纤维帽中，并且是斑块不稳定性的决定因素之一[13]。几项前瞻性研究表明，动脉钙化程度与心血管不良事件的发生率呈负相关。HUTCHESON等[14]发现，人纤维帽中钙化的形成途径包括外泌体钙化、微钙化形成和大钙化形成。其中，外泌体的内容物主要包括蛋白质和RNAs，尤其是mi RNAs能有效地改变体细胞的转录，可能是CVD中的关键串扰因子。此外，在不同刺激下，外泌体表面蛋白可用于鉴别其来源，并通过相关的抗炎或炎性蛋白影响动脉粥样硬化的发展[15]。

在以往的研究中，人们试图通过干细胞源性外泌体改善急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）的预后。众所周知，外周血肌钙蛋白水平已被用作急性心肌梗死早期诊断的生物标志物，然而最近的研究[16]表明，血浆外泌体相关mi RNAs水平也可作为AMI诊断的新生物标志物。心肌组织中含有多种外泌体相关mi RNA，如mi RNA⁃1，mi RNA⁃208b，mi RNA⁃133 a/b和mi RNA⁃499等。CORSTEN等[17]已经确定AMI患者血浆中循环mi RNA⁃208b和mi RNA⁃499高度升高，而另一项研究在AMI患者中检测到多种 p53 相关的 mi RNAs[18，19]。除了诊断 AMI外，包括MSC源性外泌体（MSC⁃exo）在内的几项临床前研究也证实了其在AMI治疗中的有益作用。在猪缺血再灌注模型中，MSC⁃exo减少梗塞范围，改善心功能[20]；AR⁃SLAN等[20]将人MSC⁃exo移植入小鼠体内，发现AMI面积减少，心功能明显改善。此外，AMI后心脏组织中腺嘌呤核苷酸水平显著升高，进一步的研究表明，经外泌体治疗后，心肌组织中p⁃AKT和糖原合酶激酶3显著升高，活性氧（ROS）减少[22]。YU 等[23]首先将锌指转录因子⁃4（zinc fin⁃ger tran⁃scription factor⁃4 ，GATA⁃4）过表达到MSCs中并提取MSC⁃exo，他们发现MSC⁃GATA⁃4⁃exo能显著减少急性心肌梗死面积，这类外泌体富含mi RNA，尤其是mi RNA⁃19a，可降低磷酸酶和PTEN水平，激活AKT和细胞外信号调节激酶。

另一个缺血性心脏病小鼠模型中，缺氧促进了CPC⁃exo的释放，进一步改变遗传物质的组成并显著降低组织生长因子、波形蛋白以及I型和III型胶原的表达[24]；进一步的研究证实低氧诱导的CPC⁃exo富含mi R⁃17、mi R⁃199 a、mi R⁃210和mi R⁃292，并通过抑制纤维化的途径保护心脏功能[25]。有研究报告了载有 mi RNAs的CPC⁃exo，例如GATA 4反应性mi R⁃451，对心脏具有保护作用[26]。然而，祖细胞或CSCs⁃exo在心脏保护中的作用机制是通过特定mi RNA的直接作用，还是通过不同mi RNA之间的相互作用来介导，仍需要探索。

再灌注治疗在抢救缺血心肌的同时，常常引起心肌缺血再灌注损伤，导致原缺血、缺氧加重。这可能与血管再通过程中ROS、炎症、钙超载和线粒体转运孔开放有关[27]。MSC⁃exo通过传递某些蛋白质和mi RNA，调节能量代谢，防止钙超载，抑制死亡受体途径，激活生存途径。CABAL⁃HIERRO 等[27]表明 MSC⁃exo可通过抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）而减少细胞凋亡。SUZUKI等[28]证实MSC⁃exo通过影响哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（m TOR）和自噬相关蛋白（ATG13）来降低自噬。因此，外泌体mi RNAs是否对心肌缺血再灌注损伤也有保护作用，有待进一步阐明。

随着经皮冠状动脉介入治疗和外科旁路移植术的发展，AMI患者的生存率明显提高。然而，失去功能的心肌细胞往往诱发心室重构，并导致AMI后的心力衰竭，长期预后不容乐观。在心衰早期，与p53基因相关的微小 RNAs（mi R⁃192、mi R⁃194和 mi R⁃34a）显著增加[19]，其中 mi R⁃194和 mi R⁃34a主要包裹在外泌体中，由心肌细胞主动分泌进入外周循环。因此，mi RNAs在循环中与左心室舒张功能显著相关，可用作潜在的生物标志物[30]。

2 外泌体的优缺点

外泌体的应用具有许多优点。（1）与干细胞移植相比，外泌体不太可能促进肿瘤发展。（2）外泌体无明显不良反应，如较少出现发热、过敏反应、溶血性反应等。（3）外泌体携带的蛋白质可产生更强的生物效应。虽然外泌体有许多显著的优点，但在应用方面也有一定限制[31]。（1）提取过程耗时长，提取量也是有限的。经典的高速离心法提取胞外泌体需要很长时间，因此，迫切需要建立提高产量的办法。（2）除了保护因子外，外泌体中同时还存在多种有害成分，因此，增加保护因子的表达，人工修饰和减少外泌体中的有害成分，具有重要意义。（3）由于通过静脉内分泌，只有很少的外泌体驻留在注射区，这极大地限制了治疗的效率[32]。最近的一项研究表明，含有某些治疗因子的神经元定向纳米颗粒直接穿透血脑屏障治疗神经系统疾病[33]，因此，这种纳米颗粒技术可以有望提供解决上述问题的替代方法。

外泌体半衰期长，广泛分布于多种体液中，因此，可以以非侵入的方式收集和识别它们的成分。目前，外泌体作为一种血清标志物，已被广泛应用于前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的诊断。虽然不可能通过鉴定单个生物标记物来诊断CVD，但是循环血液中mi RNA含量的变化可以为CVD的早期检测和干预提供新的途径。与干细胞不同的是，外泌体可以装载特定的药物，为基因治疗提供了更直接有效的途径。因此，体外操纵供体细胞，提高外泌体的作用效果，可能是今后治疗多种疾病的一种有效途径。