乙型肝炎病毒对肝癌细胞中Notch信号通路的影响

刘利平，张悦，刘林森，郭跃华，张育森，鲍世韵

(暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院，深圳 518020)

肿瘤干细胞的增殖和干性维持与Notch、Wnt、Hedgehog等信号通路密切相关[1,2]。Notch信号通路由Notch受体、Notch配体和细胞内效应器分子组成[3～5]。研究显示Notch1、Notch2、Notch3、Notch4在肝癌组织中常呈过表达状态，乙肝病毒X蛋白(HBx)可上调Notch1、Notch3、Notch4表达[6～8]。HBx是乙型肝炎病毒(HBV)编码的蛋白产物之一。HBV是肝癌的重要致病因素之一，其对Notch信号表达的影响目前少见文献报道。2016年5月～2017年3月，我们探讨了HBV对肝癌细胞中Notch信号通路的影响。

1　 材料与方法

1.1材料收集2012～2013年暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院病理科诊断为慢性肝炎组织标本10例份，其中患者男8例、女2例，年龄(56.87±9.13)岁。10例患者乙肝表面抗原均为阳性。同时收集血管瘤瘤旁(距血管瘤2 cm)组织10例份，其中患者男7例、女3例，年龄(46.53±12.69)岁。10例患者乙肝表面抗原和丙肝抗体均为阴性。检测标本均通过病理组织学检查确诊。鼠抗人Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hey1单克隆抗体均购自Santa Cruz 公司。胎牛血清、DMEM细胞培养液和脂质体转染试剂Lipofectamine2000购自美国LifeTechnologies公司。PCR引物购于Invitrogen公司。肝癌HepG2.2.15细胞由华中科技大学同济医学院附属协和医院卢银平教授馈赠。HepG2细胞购自美国ATCC细胞库。

1.2肝癌细胞中Notch通路相关基因表达检测采用Real-time PCR法。将处于对数期生长阶段的HepG2细胞和HepG2.2.15细胞种于6孔板中，待细胞80%融合时，收获上述2种细胞，提取总RNA，测定RNA的浓度和纯度。取0.5 μg的mRNA逆转录成cDNA，10倍稀释后用于PCR检测。Notch1引物序列：正向引物：5′-GTCAACGCCGTAGATGACC-3′，反向引物：5′-TTGTTAGCCCCGTTCTTCAG-3′；Notch2引物序列：正向引物：5′-ACTGTGAGGAGCAACTCGAT-3′，反向引物：5′-TCCACTTCATACTCACAGTTGA-3′；Notch3引物序列：正向引物：5′-TGACCGTACTGGCGAGACT-3′，反向引物：5′-CCGCTTGGCTGCATCAGCA-3′；Notch4引物序列：正向引物：5′-AACTCCTCCCCAGGAATCTG-3′，反向引物：5′-CCTCCATCCAGCAGAGGTT-3′；Hes1引物序列：正向引物：5′-ACACGACACCGGATAAACCA-3′，反向引物：5′-GCCGCGAGCTATCTTTCTTC-3′;Hey1引物序列：正向引物：5′-ATCTGCTAAGCTAGAAAAAGCC-3′，反向引物：5′-CGTCAAAGTAACCTTTCCCTCC-3′。总反应体积为10 μL：sybrGreen Mix 5 μL，cDNA模板1 μL，正向引物(10 μmol/L)0.5 μL，反向引物(10 μmol/L)0.5 μL，去离子水3 μL。反应条件：95 ℃变性1 min，40次循环内95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，最后72 ℃延伸7 min。基因表达采用2-ΔΔCt法计算。

1.3肝癌细胞中Notch通路相关蛋白表达检测采用Western blotting法。分别收获HepG2细胞和HepG2.2.15细胞，通过三去污裂解液提取总蛋白，定量后经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳转移至聚偏二氟乙烯膜上。加入鼠抗人Notch1、Notch2、Notch3、Notch4单克隆抗体1∶500稀释；鼠抗人Hes1和Hey1单克隆抗体1∶1 000稀释；鼠抗人β-actin单克隆抗体1∶2 000稀释。加入HRP标记的兔抗鼠二抗，1∶1 000稀释。化学发光法曝光显色。通过计算机扫描蛋白质条带进行灰度分析。以β-actin作为内参照,分别用Notch1～4/β-actin、Hes1/β-actin、Hey1/β-actin值代表Notch1～4、Hes1、Hey1蛋白的相对表达量。

1.4乙型慢性肝炎组织和血管瘤瘤旁正常肝组织中Notch通路相关蛋白表达检测采用免疫组化S-ABC法染色，检测Notch1、Notch2、Notch3、Notch4蛋白在乙型慢性肝炎组织和血管瘤瘤旁正常肝组织中的表达。Notch1、Notch2、Notch3、Notch4蛋白阳性表达为细胞质或细胞核内出现浅黄、棕黄或棕褐色颗粒[8]。

2　 结果

2.1肝癌细胞中Notch通路相关基因及蛋白表达比较 HepG2.2.15细胞、HepG2细胞中Notch1基因相对表达量分别为1.31±0.04、1.00±0.01，Notch2基因相对表达量分别为1.39±0.03、0.99±0.01，Notch3基因相对表达量分别为1.23±0.02、1.00±0.01，Notch4基因相对表达量分别为1.26±0.01、1.00±0.01，下游靶基因Hes1基因相对表达量分别为2.23±0.04、0.99±0.01，Hey1基因相对表达量分别为1.95±0.07、1.00±0.01，两种肝癌细胞中Notch通路相关基因表达比较，P均<0.05。HepG2.2.15细胞、HepG2细胞中Notch1蛋白相对表达量分别为1.71±0.12、0.99±0.07，Notch2蛋白相对表达量分别为1.68±0.09、0.97±0.05，Notch3蛋白相对表达量分别为1.57±0.08、0.96±0.04，Notch4蛋白相对表达量分别为1.53±0.09、0.96±0.07，下游靶基因Hes1蛋白相对表达量分别为3.19±0.11、0.97±0.06，Hey1蛋白相对表达量分别为2.42±0.13、0.98±0.07，两种肝癌细胞中Notch通路相关蛋白表达比较，P均<0.05。

2.2乙型慢性肝炎组织和血管瘤瘤旁正常肝组织中Notch通路相关蛋白表达比较Notch1、Notch2、Notch3、Notch4在肝炎组织中呈弥漫表达，阳性表达主要位于细胞质。Notch1、Notch2、Notch3、Notch4蛋白在肝炎组织中阳性表达率分别为90%、70%、90%、80%，在血管瘤瘤旁组织中的阳性表达率分别为20%、20%、10%、10%，乙型慢性肝炎组织和血管瘤瘤旁正常肝组织中Notch通路相关蛋白表达比较，P均<0.05。

3　讨论

肝癌干细胞被认为是肝癌发生、复发、转移和耐药的根源[6～8]。肝癌干细胞的增殖和干性维持与Notch通路的激活及表达增加密切相关。研究显示，缺氧条件下缺氧诱导因子HIF-1α胞内聚集并进入核内，与核内的HIF-1β相结合形成有活性的转录因子，通过与靶基因启动子上的CGTG结合，促进基因的转录[9]。Yang等[8]研究结果显示，Notch1～4有可能是HIF-1α的下游靶基因。Gao等[10]研究报道HBx可上调Notch1和Notch4表达。本研究结果显示，HBV可同时上调Notch1～4基因及Notch通路下游的Hes1和Hey1表达，此可能是引起肝癌细胞Notch信号通路激活的原因之一。同时我们发现，肝炎组织Notch通路亦呈激活状态，表明Notch通路的激活先于肝癌的发生。

Notch通路激活后可诱导正常细胞致瘤性转化，可促进细胞新陈代谢和葡萄糖摄取，可激活NF-κB和PI3K/AKT信号通路及抑制抑癌基因p53的表达，发挥抗凋亡作用。Notch信号通路激活后还可增强CDK2和CyclinD的活性，进而加快细胞周期进程[11,12]。研究[6～8]显示，Notch1、Notch3、Notch4高表达的肝癌患者较易出现血管侵犯，术后较易复发和转移，预后较差。阻断Notch通路的激活可抑制肝癌细胞的生长及侵袭转移。

已有研究显示抗HBV治疗在预防肝癌发生及抑制肝癌术后复发和转移中能起到良好作用[13]。本研究结果显示，HBV可激活同肝癌发生发展密切相关的Notch信号通路，此为肝炎及肝癌患者抗病毒治疗提供了新的理论基础。

参考文献：

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