LSD1在急性肾损伤肾纤维化中的保护作用及机制

赵晴，刘晓宇，刘航，杨海燕，徐岩

(青岛大学附属医院，山东青岛266003)

急性肾损伤(AKI)是常见的临床急重症之一，研究证实部分AKI患者的肾功能未能完全恢复甚至最终进展至慢性肾脏病或终末期肾病，需长期肾脏替代治疗[1]。小管间质纤维化是急性肾损伤发展为慢性肾脏病的主要病理基础[2]。TGF-β1在肾脏纤维化过程中起重要作用。组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)具有多种生物学功能，在乳腺癌的相关研究中发现，LSD1可调控TGF-β1信号通路，从而影响细胞的增殖、上皮-间质转化等过程[3]。但LSD1在急性肾损伤后肾纤维化中的作用尚不明确。2016年10月～2017年10月，我们研究LSD1过表达对急性肾损伤后纤维化进展的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料健康雄性SD大鼠(体质量约200 g，济南悦鹏动物中心)；HK-2细胞株(上海细胞库)；DMEM-F12细胞培养基(美国Hyclone)；胎牛血清(美国Gibco)；LSD1过表达质粒(上海吉凯基因)；LSD1抗体、H3K4me1抗体、H3K4me2抗体、TGF-β1抗体、α-tubulin抗体、Ⅲ型胶原纤维(Col3α1)抗体(美国Abcam)；H3抗体(美国Cell signaling)；转染试剂Lipofectamine3000(美国Invitrogen)，缺氧培养装置(美国Billups-Rothenberg公司)。

1.2动物分组及急性肾损伤模型构建取健康雄性SD大鼠30只，随机分为对照组、AKI1 d组、AKI1周组、AKI2周组、AKI4周组、AKI8周组，每组5只。AKI大鼠模型的构建：腹腔注射氯碘酮(0.002 mL/g)麻醉SD大鼠，沿背部正中做一约1.5 cm纵形切口入腹腔，游离并切除左肾，游离右侧肾蒂后用血管钳夹闭40 min，打开血管夹，用37 ℃生理盐水灌洗腹腔，关闭腹腔，分别于1 d、1周、2周、4周、8周后心脏采血后处死大鼠留取肾组织。对照组：同上述方法打开腹腔游离并切除左肾，不夹闭右侧肾蒂，于8周后心脏采血后处死大鼠留取肾组织。

1.3细胞培养及缺氧培养HK-2细胞以含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12M培养基培养，置于37 ℃、含5%CO2细胞培养箱中。缺氧培养用无糖的DMEM培养基，置于含5%CO2、95%N2的缺氧装置中37 ℃培养12 h，后换为正常培养基置于含5%CO2细胞培养箱中培养1 h。

1.4LSD1过表达质粒转染细胞将HK-2细胞分为4组：对照组、AKI组、AKI+空质粒组、AKI+LSD1过表达组，对照组未转染质粒，AKI组缺氧培养，AKI+空质粒组转染阴性对照质粒后缺氧复氧培养，AKI+LSD1过表达组转染LSD1质粒后缺氧复氧培养。将HK-2细胞种植于六孔板上，以正常培养基培养至细胞密度75%，换为不含血清的DMEM/F12培养基，按照Lipofectamine3000说明书进行转染，4 h后换为正常培养基，12 h后进行缺氧培养或正常培养。

1.5大鼠肾组织中TGF-β1、LSD1、Ⅲ型胶原(Col3)α1蛋白表达检测采用蛋白免疫印迹法。收集肾组织及细胞，提取总蛋白，以BCA法定量，取总蛋白量20 μg的细胞及组织裂解液以10%SDS-PAGE电泳分离，以湿转法转至PVDF膜。以5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜，PBST洗膜3次，每次洗15 min，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，每次15 min，用化学发光试剂盒(美国Pierce)应用VILBER Fusion FX7成像系统进行显影。

1.6TGF-β1基因启动子上H3K4me1及H3K4me2表达检测采用染色体免疫共沉淀(ChIP)法。用甲醛使细胞体内的蛋白和染色体交联，超声3次使核膜碎裂，测DNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段大小。向待测样品中分别加入1∶50稀释的H3K4me1、H3K4me2和阴性对照抗体IgG，于转子上4 ℃孵育过夜。利用ChIP缓冲液和磁珠将染色质从蛋白上洗脱并解交联，用离心柱纯化DNA，将纯化后的DNA进行RT-PCR。TGF-β1激动子:正向引物:5′-ATCCCGGTGGCATACTGAG-3′，反向引物:5′-CACGGAACTTCGGAGAGC-3′。结果以相对于阴性对照抗体的倍数呈现。

2　结果

2.1大鼠急性肾损伤后TGF-β1及LSD1表达变化 对照组、AKI 1 d组、AKI 1周组、AKI 2周组、AKI 4周组、AKI 8周组TGF-β1蛋白相对表达量分别为0.25±0.03、0.28±0.02、0.41±0.03、0.65±0.03、0.75±0.02、0.56±0.03，LSD1蛋白表达量分别为0.42±0.04、0.43±0.05、0.65±0.05、0.97±0.04、1.15±0.08、0.88±0.06。与对照组相比，AKI 1d组TGF-β1蛋白表达量无明显变化，AKI 1、2、4、8周组 TGF-β1蛋白表达量较对照组均有不同程度升高(P均<0.05)，AKI 4周组TGF-β1蛋白表达升高最明显。同样与对照组相比，AKI 1、2、4、8周组LSD1蛋白表达均增高(P均<0.05)，且AKI 4周组升高最明显，与TGF-β1升高趋势相同。

2.2各组大鼠肾组织中Col3α1蛋白表达比较 对照组、AKI 1 d组、AKI 1周组、AKI 2周组、AKI 4周组、AKI 8周组Col3α1蛋白相对表达量分别为0.99±0.16、1.16±0.10、1.23±0.06、1.32±0.07、1.75±0.10、1.54±0.08;与对照组相比，AKI 1、2、4、8周组大鼠肾组织中Col3α1蛋白表达增多(P均<0.05)，AKI 4周组增加最明显，而AKI 1d组Col3α1表达无统计学差异(P>0.05)。

2.3各组大鼠肾组织中H3K4甲基化表达量比较对照组、AKI 1 d组、AKI 1周组、AKI 2周组、AKI 4周组、AKI 8周组H3K4me1蛋白相对表达量分别为0.61±0.08、0.62±0.04、1.06±0.15、2.06±0.12、2.79±0.12、1.88±0.19，H3K4me2蛋白相对表达量分别为0.65±0.04、0.63±0.04、0.61±0.06、1.14±0.09、1.49±0.08、0.73±0.05。与对照组相比，AKI 1、2、4、8周组 H3K4me1均有升高，差异有统计学意义(P均<0.05)，H3K4me2变化不如H3K4me1显著，但与对照组相比，AKI 2及AKI 4周组升高，差异有统计学意义(P均<0.05)。且H3K4甲基化的变化趋势与LSD1一致，均在AKI后4周时升高最明显。

2.4各组HK-2细胞H3K4me1及H3K4me2蛋白表达量比较对照组、AKI组、AKI+空质粒组、AKI+LSD1过表达组H3K4me1蛋白相对表达量分别为1.11±0.04、1.72±0.04、1.67±0.04、0.59±0.04， H3K4me2蛋白相对表达量分别为1.63±0.06、1.94±0.07、2.00±0.07、1.28±0.06。与对照组相比，AKI组及AKI+空质粒组H3K4me1及H3K4me2表达量均增加(P均<0.05)。与AKI组及AKI+空质粒组相比，LSD1过表达组H3K4me1及H3K4me2表达量下降(P均<0.05)。

2.5各组HK-2细胞纤维化相关蛋白表达量比较 对照组、AKI组、AKI+空质粒组、AKI+LSD1过表达组Col3α1蛋白相对表达量分别为0.59±0.04、1.22±0.05、1.18±0.04、0.68±0.05，与对照组相比，AKI组及AKI+空质粒组Col3α1表达增加(P均<0.05)，但两组间比较差异无统计学意义。与AKI组及AKI+空质粒组相比，AKI+LSD1过表达组Col3α1表达明显下降，组间比较,P均<0.05。

2.6各组HK-2细胞LSD1、TGF-β1mRNA及蛋白相对表达量比较对照组、AKI组、AKI+空质粒组、AKI+LSD1过表达组LSD1 蛋白相对表达量分别为0.53±0.05、0.83±0.04、0.84±0.04、1.52±0.04，TGF-β1蛋白相对表达量分别为0.67±0.05、1.12±0.05、1.05±0.05、0.67±0.05。与对照组相比，AKI组、AKI+空质粒组TGF-β1表达增加(P均<0.05)，与AKI组及AKI+空质粒组相比，AKI+LSD1过表达组TGF-β1表达下降(P均<0.05)。

2.7各组HK-2细胞TGF-β1启动子上组蛋白表达比较对照组、AKI组、AKI+空质粒组、AKI+LSD1过表达组TGF-β1启动子上H3K4me1表达量分别为0.33±0.07、3.27±0.34、3.42±0.39、0.69±0.10，H3K4me2表达量分别为0.19±0.02、1.80±0.07、1.87±0.06、0.45±0.11。与对照组相比，AKI组及AKI+空质粒组TGF-β1启动子上H3K4me1及H3K4me2表达增加，差异有统计学意义(P均<0.05)，而两组之间差异无统计学意义；与AKI及AKI+空质粒组相比，LSD1过表达组TGF-β1启动子上H3K4me1及H3K4me2表达下降，差异有统计学意义(P均<0.05)。

3　讨论

急性肾损伤后正常肾脏组织可通过修复机制恢复正常的肾功能，但如果修复机制受损、损伤较重或导致损伤的因素持续存在，便会导致不可逆的组织重塑及纤维化，进展为慢性肾损伤。急性肾损伤后机体通过自分泌或旁分泌途径激活间质成纤维细胞及小管上皮细胞等细胞，导致以胶原为主的细胞外间质生成过多，形成肾脏纤维化[4]。

越来越多的证据表明纤维化过程中染色体表观遗传标志物H3K4me表达增加，组蛋白H3K4甲基化可促进TGF-β1的表达，进而促进纤维化过程的进展[5,6]。在黄素腺嘌呤二核苷酸的参与下，LSD1可特异去除组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4) 的二甲基和一甲基修饰[7]。同时LSD1具有多种生物学功能，可作用于包括各种转录因子、p53及Dnmt1 蛋白等，从而在基因表达的调控中起重要作用[8～10]。近年来LSD1在肿瘤中的研究甚多，研究证实LSD1在乳腺癌中可调控TGF-β1信号途径，进而调控细胞增殖及上皮间质转化的发生过程[13]。而在肾脏纤维化中，LSD1是否可通过使H3K4去甲基化减轻肾纤维化进展尚少见报道，为此该研究设计了急性肾损伤后肾纤维化模型，并通过质粒转染使LSD1过表达，进而研究LSD1对肾脏纤维化的影响。

Col3是细胞外基质的重要组成成分，是纤维化发生的标志。本研究制作了缺血再灌注的AKI大鼠模型，并观察到AKI后大鼠肾组织中细胞外基质重要成分Col3α1表达增加证实了AKI后大鼠肾脏确实发生了纤维化。本研究同时观察到AKI后纤维化过程中H3K4me1及H3K4me2表达均增加，但H3K4me2变化不如H3K4me1变化显著，而与预期结果相反，H3K4甲基化增加的同时LSD1表达也增加，本研究考虑LSD1是纤维化过程中机体的保护因子，LSD1表达增加是机体为减轻组蛋白甲基化的自我保护机制。在细胞实验中，LSD1过表达后，经缺氧复氧处理的AKI HK-2细胞较正常表达LSD1的HK-2细胞纤维化指标明显下降，从而证实LSD1可减轻AKI后肾纤维化的进展。

大量研究证实TGF-β1是AKI后肾纤维化过程中的核心因子，炎症过程中巨噬细胞产生大量TGF-β1，TGF-β1可启动经典途径及非经典途径，发挥多种生物学功能，其中Smad信号途径是TGF-β1致肾脏纤维化作用的主要信号途径。纤维化过程中Smad3高度活化，活化的Smad3可使抑制性的Smad7下调，Smad3和Smad7的失调会导致肌成纤维细胞的活化和聚积，使细胞外基质生成过多、降解下降，导致肾脏纤维化进展[12,13]。该研究观察到AKI后各组TGF-β1表达较对照组明显增加，其变化趋势与LSD1变化趋势一致，而在细胞实验中发现LSD1过表达可使AKI细胞TGF-β1表达下降。本研究发现，急性肾损伤后TGF-β1启动子上H3K4me1及H3K4me2表达增加，而LSD1过表达可使TGF-β1启动子上H3K4me1及H3K4me2表达下降。因此我们推测，LSD1通过使H3K4me1及H3K4me2去甲基化抑制TGF-β1表达，从而减轻AKI后肾纤维化进展。

综上所述，LSD1可通过使H3K4me1及H3K4me2发生去甲基化，使TGF-β1表达下降，从而在AKI后肾纤维化过程中起保护作用。

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