大豆脂肪氧化酶研究进展

刘 博 ，卫 玲 ，肖俊红 ，杨海峰 ，段学艳 ，陈爱萍 ，任瑞兰 ，肖 磊

（1.山西省农业科学院小麦研究所，山西 临汾 041000；2.邯郸市农业科学院，河北 邯郸 056001）

脂肪氧化酶是一类含非血红素铁、不含硫的过氧化酶，球型，可溶，无色，其分子量在动物中为75～80 ku，植物中为90～104 ku，其在动植物和微生物中普遍存在，在真核细胞生物中参与不饱和脂肪酸的代谢[1-5]。

1932年，脂肪氧化酶（简称Lox）首次在大豆中被发现[6]，它仅占大豆总蛋白的1%～2%[7]，但是能够专一催化多元不饱和脂肪酸的加氧反应，形成具有共轭双键脂肪酸氢过氧化物。这些产物经过解裂酶分解，产生醇、酮、醛类等挥发性物质，进而形成豆腥味[8-10]。脂肪氧化酶及其代谢产物一方面在植物营养生长、防御反应、抗逆性等方面具有积极作用；另一方面造成了豆腥味等不良气味产生、降低了大豆的营养品质，在一定程度上缩短了大豆的储藏期。因此，研究大豆脂肪氧化酶具有非常重要的意义。

从遗传机制及育种改良、检测技术与手段方面综述了大豆脂肪氧化酶的研究进展，旨在为相关研究提供借鉴和参考。

1 脂肪氧化酶遗传机制及育种改良

1.1 国外研究

20世纪40年代和70年代，THEORELL等[11-13]先后分离纯化了大豆脂肪氧化酶的3种同工酶Lox1，Lox2 和 Lox3 （Lox3a，Lox3b），其中，Lox3a，Lox3b在许多性质上相似，被认为是同一种同工酶。3种酶同源性较高，同源序列中N末端均有氨基酸组成的桶状结构，C末端均有一段氨基酸保守区域，该区域作为酶蛋白活性中心，从而调节酶活性。当3种酶对应基因均为隐性（即lx1，lx2，lx3）时，Lox1，Lox2和Lox3全缺失，豆腥味全无。前人研究表明，lx1与lx2紧密连锁，lx3独立遗传[14]。

1995年，日本学者NISHIBA等[15]用正常大豆与各类型Lox缺失体比较，结果发现，水状均质豆粉中脂肪酸过氧化作用指标（DETBA值）和己醛生成量最低值均为Lox全缺失体。NISHIBA等[16]研究加水均质豆粉及豆奶维生素E含量、清除自由基（DPPH）活性的品种间差异，结果发现，Lox全缺失体有最高水平的维生素E含量和清除DPPH自由基活性，说明Lox全缺失体具有更高的营养价值。目前，国外报道，筛选出了3种类型Lox自然缺失体，并育成了以美国Century、日本Suzuyutaka近等基因系为代表的品种或种质资源，用于研究和育种。比较典型的有日本育成的低豆腥味品种“梦丰”，无豆腥味品种“中育37”，韩国育成的“真品豆”等。

1.2 国内研究

我国对脂肪氧化酶研究相对较晚。1994年，中国农业科学院作物科学研究所丁安林等[13]首先开展大豆种子脂肪氧化酶、同工酶缺失体的研究。之后，傅翠真等[17]对我国大豆脂肪氧化酶缺失种质多样性进行了鉴定，结果表明，国内发现的Lox缺失类型为Lox1，Lox2，Lox3和Lox2.3，共4种。麻浩等[18]对不同Lox缺失体近等基因系豆腥味研究结果表明，3种酶对豆腥味贡献程度大小为Lox2＞Lox1＞Lox3，即Lox2作用最大，Lox1作用居中，Lox3作用最小。

我国大豆研究人员在“九五”期间，建立了大豆脂肪氧化酶缺失突变基因（lx）的蛋白标记和lx1的RAPD标记1个，lx2和lx3的特异PCR标记各1个，并用这些分子标记辅助育种，育成了低豆腥味大豆新品种中黄 18（Lox2缺失）、中黄 16（Lox2.3，Ti缺失）、无腥1号（Lox2.3缺失）和一批Lox双缺的品种或种质。刘艺苓[19]运用基因工程手段，克隆大豆脂肪氧化酶基因，同时采用种子特异型启动子构建RNAi表达载体，以期抑制大豆脂肪氧化酶基因的表达，最终降低脂肪氧化酶的含量。马建[20]将RNA干扰技术应用于改良大豆脂肪氧化酶含量，取得了良好效果，获得了脂肪氧化酶含量明显降低、脂肪含量明显提高的转基因大豆植株，克服了常规育种易受种质资源限制和育种时间长的缺点，实现了大豆育种方法的创新。赵艳等[21]从大豆基因组DNA中分离脂肪氧化酶-3基因启动子片段Lox3p，其利用PLACE在线启动子预测工具分析发现，序列中含有多种典型的种子及胚特异性表达元件，将克隆得到的Lox3p片段构建表达载体pCAM-Lox3p，并通过农杆菌介导法在大豆种子中进行瞬时表达，GUS组织化学染色和荧光测定都显示，Lox3p驱动GUS基因表达的强度高于CaMV35S启动子，结果表明，Lox3p启动子片段具备一定的胚特异表达特性。王丹等[22]应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶（Lox）和胰蛋白酶抑制剂（KTi）基因的表达，改良大豆品质，培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。

在育种方面，河北省农林科学院粮油研究所使用美国Century和日本Suzuyutaka脂肪氧化酶缺失近等基因系培育出五星1号、五星2号、五星3号、五星4号、冀豆12-2、冀豆12-3、冀豆12-2.3、冀豆12-3L、冀豆9号-3L等系列脂氧酶缺失优异品种（种质），该系列母本为当地品种，父本为美国和日本来源的脂肪氧化酶缺失种质。其中，五星4号为我国第1个脂肪氧化酶全缺失的无腥味大豆审定品种[23]。国内其他科研院所也积极开展相关方面的研究，其中，黑龙江农业科学院绥化研究所育成了绥无腥豆1号；山东省农业科学院作物研究所大豆研究室研究人员以抗病、高产、广适的鲁豆4号为母本，以美国种质Century为父本，育成了无豆腥味优质大豆鲁93125-4；河南省科研人员育成中特1号、郑优1号等。目前，国内大豆脂肪氧化酶研究已取得了不少成绩，育成了一定数量品种。

2 脂肪氧化酶检测技术和方法

脂肪氧化酶检测技术除了常规品尝，还有一些方法：张瑛等[24]利用脂肪氧化酶的偶联氧化还原指示剂而显色快速检测植物脂肪氧化酶，该技术具有操作简便、快速，结果直观、准确，能进行定性和定量分析；吴培培等[25]利用紫外分光光度计和酶标仪测定脂肪氧化酶活性，同时利用控制脂肪氧化酶活性位点的紧密连锁的分子标记Xwmc312以及功能标记 LOX16和 LOX18，采用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离技术进行参试材料的LOX基因型鉴定。

3 脂肪氧化酶缺失对大豆贮藏的影响

王若兰等[26]对8个脂肪氧化酶不同程度缺失大豆品种和1个正常大豆品种进行了40℃耐高温存贮品质变化试验，结果表明，脂肪氧化酶缺失品种相同的存贮时间后，其发芽率、粗脂肪含量、水溶性氮指数均高于普通品种，脂肪酸成分变化和色泽优于普通品种，脂肪酸值和过氧化值低于普通品种。由此可见，脂肪氧化酶缺失确实有利于大豆营养品质的保护，有利于延长大豆保质期。这可能是由于正常品种中存在脂肪氧化酶，能催化细胞膜中不饱和脂肪酸和脂肪酸氧化，形成脂肪酸氢过氧化物和自由基，造成细胞膜通透性增加等危害，进而对贮藏造成不利影响[27]。

4 结论与展望

供给侧改革要求体现到大豆生产方面，除了要保证产量，还需要提高品质，市场对无腥大豆有较大需求。无腥大豆在育种、生产、生活、大豆精深加工产业等方面的研究具有广阔的应用前景。脂肪氧化酶缺失品种培养和研究，作为从根本上消除豆腥味的方法，对提高大豆营养品质、改善风味、简化精深加工程序、降低加工成本、延长贮藏期等方面具有重要意义。

目前，对大豆脂肪氧化酶遗传规律的研究较清楚，但对具体调控作用机制及与其他性状关系等方面不甚了解。已报道的检测脂肪氧化酶的方法和手段、程序和操作逐渐简化，成本逐渐下降。今后种质改良方面，应充分重视现代分子生物学和生物信息学技术，除了通过开发功能标记（标签）或紧密连锁分子标记进行分子标记辅助选择育种、设计育种外，可使用RNA干扰、基因编辑技术提高育种效率。具有优良性状的基因组编辑大豆产品已逐步从实验室走向田间，并展现了较传统转基因作物更为优越的应用前景[28]。同时，不可偏废常规杂交育种技术应用。检测方面，可尝试探索表观（宏观）性状与脂肪氧化酶缺失关系，通过简单的表观性状（甚至品尝吃味）等标准建立，筛选脂肪氧化酶缺失品种（种质），创造更为简单、可靠、可行、低成本的检测筛选方法和技术。

应积极开展针对当地特定生态环境、生产条件和加工需求的具有自主知识产权的脂肪氧化酶缺失种质（品种）研究与应用，解决大豆的地区适应性较明显带来的直接引种造成的局限性和风险。

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