多模态超声成像技术动态分析支架特性的研究进展

刘徐妹，陈彦

(1南方医科大学，广州510515；2南方医科大学珠江医院)

组织工程是指将种子细胞接种至可降解的支架材料上，通过支架中细胞的增殖、细胞外基质(ECM)分泌以及支架材料自身的逐渐降解，最终在体外或体内构建组织或器官替代物的技术。支架材料是组织工程三大要素之一，而动态分析支架特性始终是组织工程领域亟待解决的难题之一。因此，研发一种可动态分析支架特性的简便、无创性检测技术至关重要。传统检测方法，如标本组织学切片染色法、直接机械测量法和重量法等，大多需以牺牲动物为代价，无法进行连续性评估，也无法直接应用于人体或培养条件下的支架材料。近年来，多模态超声成像技术为支架材料特性分析提供了新思路，并以其便捷、无辐射、无创、实时等特点在组织工程领域表现出较高的应用价值。本文将多模态超声成像技术在评估支架特性方面的研究进展进行系统回顾，以期促进超声医学工程学的发展和加速其临床转化。

1 多模态超声成像技术及其评估支架特性的基本原理

多模态超声成像技术可用于无创评估支架材料特性，评估相关技术主要包括灰阶超声、超声背向散射技术(BUS)和超声弹性成像(UEI)等，它们的原理及评估方法不尽相同，可互为补充。

灰阶超声利用超声波在材料或组织中传播时反射的回波信号进行成像，回波强度以灰阶(亮度)形式显示。当支架特性变化时，支架内部声阻抗差会出现相应变化，从而图像灰阶值大小也会随之变化，因此通过图像灰阶值变化可间接反映支架特性变化。

BUS是一种可定量分析组织微结构特征的方法，原理基于灰阶超声，但在射频信号处理前，通过特制时间门控电路提取感兴趣区域的原始射频信号进行定量分析，从而获取多种声学参数，如背向散射积分(IBC)、斜率(slope)和中频带拟合(MBF)等。这些参数与组织或材料微结构大小、密度及组成等密切相关，因此BUS可以用于定量表征组织的微结构特征。

UEI的基本原理是对组织施加一个静态或动态激励，在弹性力学、生物力学等物理规律的作用下，组织会产生一个响应，如应变、位移、速度等分布产生一定改变，再利用超声成像方法和数字信号处理技术估测出组织内部的响应程度，从而间接或直接反映组织内部弹性模量等力学特性的差异。欧洲超声协会联盟2017年最新发布的分类指南[1]将UEI分为应变弹性成像(SE)、声辐射力脉冲(ARFI)成像和剪切波弹性成像(SWE)三类。而ARFI成像和SWE均以声辐射力作为激励方式，也称为声辐射力弹性成像技术。目前用于支架特性评价的UEI技术包括SE、传统ARFI成像、双模态UEI (DUE)[2]、单点式SWE(pSWE)[1]和超高速SWE(SSI)[1]。

2 多模态超声成像技术对支架特性的监测分析

2.1 灰阶超声动态分析支架材料的结构和组成特征 灰阶超声为支架材料的可视化提供了一种简便、实时、无创的手段。Solorio等[3]利用诊断性超声(12 MHz)实时、直观地呈现了聚乳酸-羟基乙酸原位凝胶递药系统(ISFI)的液-固相变过程，使持续动态监测ISFI的形成过程成为可能。该技术不仅可长时间动态分析植入物体积的变化情况，还可动态评估其外溢或纤维包裹情况，为体内、外监测ISFI的形成过程和其内药物的释放速率提供了重要信息。研究表明[4, 5]，诊断性超声也是一种可实时、原位、定量分析支架材料组织再生的新型手段，弥补了传统方法有创、耗时长、不可重复等不足。支架中ECM的沉积量是其组织再生的重要评价指标。Kreitz等[5]定量监测了一种肌纤维母细胞-纤维蛋白凝胶支架(培养条件下)的灰阶值大小，并分析了其与支架中ECM沉积量之间的关系，发现其灰阶值与ECM含量之间呈强线性关系，说明诊断性超声可用于定量评估支架材料组织再生情况，且具有较高的评估效能。Chen等[6, 7]通过诊断性超声(12 MHz)介导可注射性壳聚糖支架或接枝的壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原(CS/nHAC)复合支架的注入和监测此类成骨支架材料的体内过程，研究表明诊断性超声不仅可以直观、安全、准确地介导骨支架材料的注入，还能无创性监测可注射性骨支架材料的固化过程和支架在体内的降解、骨再生等情况。Chen等[8]还发现诊断性超声对可注射成骨支架材料体内成骨能力和降解速率的评估效能与CT相当。高频超声(>20 MHz)可明显提高图像空间分辨率，已用于体外表征支架材料特性，可对水凝胶支架进行立体成像，直观地呈现了其内细胞或微粒的浓度差异和空间分布情况[9,10]。

灰阶超声具有便捷、经济、实时、无创、安全等优点，在表征支架的结构和组成特征中表现出较大的应用价值，其应用有助于加速组织工程与再生医学技术和产品的临床转化，但也存在一定局限性，如易受系统参数设置和操作者经验的影响、仅提供宏观信息等。

2.2 BUS定量评估支架材料的微结构 近年来，BUS已证实可用于定量分析支架中细胞、胶原纤维、矿化物质等微结构，且其获取的声学参数(如IBC、slope、MBF等)与超声系统设置、换能器特性无关，可提供有价值的量化评估指标。通过获取IBC值，BUS可估算支架中细胞浓度和胶原蛋白含量，且能应用于培养条件下的支架材料，扩宽了传统检测技术的应用范围，为快速检测支架中的细胞浓度和胶原含量提供了一种无创性方法。Mercado等[11]研究发现，琼脂糖凝胶支架的IBC值大小与其细胞浓度呈线性关系，证实IBC值可作为估算支架中细胞浓度的量化指标。Mercado等[9]还发现IBC值大小与支架材料中胶原蛋白含量同样具有线性关系，表明IBC值也用于估算支架胶原蛋白含量，并能提供胶原微结构的空间分布信息，为组织工程研究提供重要的功能信息。除了获取IBC值，BUS还可以通过射频信号分析技术获取slope和MBF等声学参数，而这些参数与工程组织和支架材料中微结构(如细胞和矿化物质)的尺寸、浓度和声阻抗等相关，因此也可作为该技术重要的量化指标。目前，slope和MBF两种声学参数已用于体外动态分析成骨支架材料的成骨作用和成骨细胞的分化程度。Mercado等[9]通过分析slope和MBF两种参数来动态监测三维胶原蛋白支架的矿化过程，发现MBF和slope分别与矿化物质含量和颗粒大小密切相关。MBF可作为矿化物质含量的量化指标，而slope则是反映颗粒大小的敏感指标。

BUS具有定量分析支架微结构特性的能力，通过分析细胞、胶原蛋白和矿化物等多种微结构的粒径大小、含量和空间分布等情况来反映支架的功能状态，为组织工程研究提供重要的功能信息。虽然BUS不受系统参数设置的影响，弥补了灰阶超声的不足，但目前该技术只能应用于体外监测，并且数据处理过程较复杂，标准化的声学参数指标尚未拟定，仍有待进一步发展。

2.3 UEI动态分析支架材料的力学特性 UEI技术可采用体外评估和体内无创性监测两种方式动态分析支架的力学性能，通过获得具有较高空间分辨率的二维弹性图像，监测材料的硬度变化。目前主要应用于评价组织工程骨、软骨、血管、角膜和黏膜等支架材料的研究。

SE技术在评价支架力学性能中的应用最为广泛。SE技术可检测的硬度范围为47 kPa～4 MPa，能够用于检测超过软组织硬度的组织或材料，如支架材料、递药系统等[12]。该技术可通过动态分析支架的力学性能变化来监测其降解和组织再生情况。Kim等[13]发现聚柠檬酸-1,8-辛二醇酯可降解支架的平均应变值随支架的降解而明显增大，而应变值的变化曲线与机械测量获取的弹性模量变化曲线高度拟合，证明了SE技术监测支架降解的可行性。Zhou等[14]利用SE技术成功监测了ISFI的腐蚀进程，结果发现材料的平均应变值和侵蚀值之间存在的强线性关系。支架的力学特性不仅受降解的影响，还会受组织再生的影响，因此通过UEI技术测得的弹性模量变化通常是其降解和组织再生的综合结果。Yu等[15]建立大鼠腹壁修复模型和采用SE技术实时监测3种多孔高分子支架材料的力学性能变化，证实了该技术可用于监测支架材料的体内重塑过程。Chen等[16]发现实时弹性成像也可用于记录可注射CS/nHAC成骨支架材料的体内过程，通过获取对照区和材料区的应变比值可以半定量分析支架的力学特性变化，进而评估支架体内成骨过程,其应变结果与microCT结果相吻合。SE技术由于其简便、实时、经济、安全等特点仍具有较高的应用价值，但存在一定局限性，如易受主观经验影响、缺乏客观定量指标、应用范围限于浅表组织等。

ARFI成像技术已用于评估支架材料的黏弹特性。支架材料是黏弹性物质，其弹性和黏性对其功能化均具有重要意义，但是目前绝大多数研究只表征其弹性属性，而忽略了其黏性属性。黏弹性物质可视为弹性体和液体的混合物，当其发生应变的时候，其弹性部分承担静态应力，而液体部分不承担静态应力。由于液体具有黏滞性，黏弹性物质在应力作用和撤销时的应变都有不同程度的滞后。因此，ARFI成像技术利用超声波向支架局部施加辐射压力 ,使支架会产生一定应变，瞬时终止声辐射力，让支架恢复至响应前的状态，通过检测支架应变-恢复过程中不同时间的应变程度，即可反映组织的黏弹特性。早期的ARFI成像技术是利用单一的超声系统进行成像，无法同时兼顾声辐射力大小和图像空间分辨率，应用受限。DUE技术[2]通过将激励系统和成像系统分开进行成像，完好地解决了早期ARFI成像技术存在的问题。该技术既能满足所需声辐射力的要求，又能描绘出高分辨率的黏弹性图像，其空间分辨率可达亚毫米级别，使支架微观特性评估成为可能。Hong等[17]证实DUE技术用于评估水凝胶支架材料黏弹特性的可行性，直观地呈现了支架整体或不同深度层面的黏弹性情况。DUE技术是采用高频聚焦超声进行组织激励，在成像过程中会产生一定的热量，这些热量可能会对支架的生长产生影响。DUE技术在支架微观力学特性评估中表现出巨大的应用潜能，但其有效性和安全性仍需进一步探究。

SWE技术在动态分析培养条件下或深部组织内支架的力学特性中表现出独特优势。该技术是通过检测声辐射力所激发的剪切波进行成像，无需依赖外力施压，可对组织弹性进行客观、定量评估，弥补了传统SE技术的不足。早期的pSWE技术是利用不同角度的声束聚焦到目标组织来激发剪切波的产生，再通过检测激发点旁剪切波传播的平均速度来评估组织硬度，但该技术在评价培养条件下支架时会因液-固交界区域产生的Scholte表面波的混淆而低估剪切波速度，且其所需的声能较大，每次聚焦后均需待探头晶片冷却后才能进行下次聚焦，无法进行实时测量，耗时较长，应用受限。目前最新应用的2D-SWE该技术(即SSI技术)是利用超高速超声扫描仪产生平面剪切波源并追踪其在组织内的传播，进而获取实时、量化的二维弹性图像，可实时直观显示支架的软硬程度和定量检测支架的弹性模量值[18]。Nguyen等[19]将该技术应用于测定离体或活体角膜的弹性和各向异性，发现角膜的最大硬度区域均与预期的胶原纤维区域相一致，表明SSI技术可对离体或活体角膜进行量化评估。Park等[20]首次应用SSI技术对活鼠体内支架的硬度进行实时监测，发现剪切模量结果与利用直接机械测量获取的杨氏模量结果高度一致，表明SSI技术对活体内支架的硬度评估效果好，并能获取实时、量化的支架弹性图像，为组织工程的研发提供客观、定量的力学特性信息。但目前该技术在组织工程的应用中仍处于初级阶段，支架材料不均质性、各向异性和黏弹性等的评估是研究的难点，有待进一步探究。

综上所述，多模态超声技术在动态分析支架特性中表现出较高的应用价值，可实时、原位分析支架材料的结构、组成和力学性能等，为组织工程的实验设计和术后监测提供重要信息。不同超声成像技术各具特点，相辅相成。灰阶超声在动态分析支架结构和组成特点中的应用价值明确，虽然其存在一定局限性，但是未来仍有望在支架材料的前临床实验和临床评估中发挥重要作用。BUS在定量分析支架微结构特性中表现出较大的应用价值，将来有望成为功能化组织工程的重要评估手段，但是目前仍无法应用于临床，有待进一步发展。UEI在动态分析支架材料的力学性能中表现出独特优势，其研究重点已从SE转向声辐射力弹性成像技术，尤其是SWE技术。迄今为止，三维UEI尚未应用于支架特性的评价，相信未来该技术在组织工程领域也将发挥无可替代的作用。超声成像技术有望成为一种无创性组织工程“探针”，不仅可以原位分析支架材料特性而不影响其性质和微环境，还能长时间实时监测支架特性变化。

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