茶多酚纳米载体制备技术及其药理活性研究进展

林清霞，杨军国，宋振硕，王丽丽，陈 林

(福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015)

茶多酚系茶叶中最主要的生物学活性成分，其主要组分为儿茶素类，研究表明其具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎抗菌、降血糖、防辐射等多种保健功效，是一类具有广泛应用价值的功能因子[1-3]。然而，因其易被氧化、碱性条件不稳定、生物系统内代谢率高等问题，导致茶多酚生物利用度低，限制了茶多酚由实验室向实际应用领域的拓展[4-7]。国内外学者探索研究多种方法提高茶多酚的药理活性表达，诸如基团修饰[8]、胶囊化[9]、纳米颗粒[10]、与其它成分协同使用[11-12]等，尤以纳米包埋技术发展前景最为广阔[13]。纳米包埋茶多酚技术已开展了广泛的研究，多类降解材料可被用于制备茶多酚的纳米载体，在改善茶多酚稳定性及提高生物学活性表达方面展现了显著的作用效果。本文结合近年来纳米包埋茶多酚研究的相关文献报道，主要对茶多酚纳米包埋技术及其生物学活性表达的研究进展进行综述。

1 茶多酚的纳米载体研究

纳米技术就是将药物包埋于纳米粒子内部或吸附于纳米粒子表面，使药物或食品功能因子免受胃肠环境的影响，从而达到延缓释放、减少药物用量和提高生物活性的目的[14]。目前，国内外学者针对茶多酚包埋载体材料已开展了广泛的研究，改善茶多酚稳定性效果显著。

1.1 脂质体

脂质体作为一种新型的运载体系，因其具有生物可降解性、生物相容性、靶向性、无毒性等特性，被广泛应用于食品、医药、化妆品等领域[15-16]。脂质体是由磷脂和胆固醇组成的一种类似生物膜的自组装胶束微粒，其独特的双亲性结构可以同时包埋亲水性和亲油性药物。采用脂质体制备药物载体，可以提高易氧化药物在体内外的稳定性，降低被包埋药物的毒性、促进肠道对被包埋物质的吸收，提高其生物利用率[17]。

脂质体作为包埋茶多酚的载体材料确实具有许多优点和特点，但就目前情况来看，仍旧存在一些限制性因素，例如(1)贮存稳定性欠佳，易发生聚集、融合、乳化等，包裹率低、在体外被包埋物易于从脂质体中渗漏[20]；(2)磷脂双键被氧化、酯键水解，使脂质体的结构发生不可逆变化，并且水解产物对人体存在一定的毒性[21]；(3)脂质体在体内吸收过程中，易被巨噬细胞吞噬，降低其包封药物的药效等[22]。针对传统脂质体存在的问题，国内外学者通过化学合成或生物合成的方法，对脂质体进行修饰，其常见的修饰剂有壳聚糖、海藻酸盐、聚乙二醇、二氧化硅等[23]。

郝晓帧[24]选取不同的表面活性剂对茶多酚(TP)脂质体进行修饰，发现表面活性剂的种类及用量对TP脂质体的粒径及稳定性有显著影响，采用表面活性剂司盘80能够提高TP脂质体的透皮性能。刘珍[25]利用乙醇注入结合动态高压微射流方法制备了茶多酚纳米脂质体(TPN)，在此基础上对脂质体进行修饰，制备了壳聚糖-脂质体(CH-TP)和二氧化硅-壳聚糖-脂质体(S-CH-TPN)，试验显示，修饰剂的存在影响了脂质体膜结构的刚性和抗应变能力，修饰后的脂质体稳定性、缓释效果以及DPPH自由基清除能力均显著提高，例如，二氧化硅的引入让体系的分布更为细腻和均匀，分散系数表现为最小值0.22±0.01，而未修饰的TPN分散系数为0.29±0.01。TPN在85，100，125 μg·mL-1的DPPH自由基清除能力分别为53.28%±1.8%，60.38%±2.1%和64.29%±1.0%，CH-TPN的DPPH自由基清除能力分别为65.46%±3.9%，71.03%±3.3%和72.19%±3.7%，高于TPN所示值，而S-CH-TPN则表现出80.14%±1.9%，81.38%±2.1%，88.89%±1.1%的DPPH自由基清除能力，明显高于TPN和CH-TPN自由基清除值。体外消化试验和单独的肠液消化试验表明，CH-TPN和S-CH-TPN在胃液环境下始终保持高稳定性，对茶多酚表现出良好的体外消化保护效果。Radhakrishnan等[26]采用乳化剂挥发法将EGCG包封在脂质体纳米粒中，制备出EGCG-SLN。EGCG-SLN在血清中表现出高稳定性和高耐电解质诱导性。以磷脂、乙醇、水制备的纳米悬浮液是一类新型的脂质载体，由于乙醇与脂质双层的交叉作用以及乙醇的加入增加了角质层中脂质的流动性，则该类纳米悬浮液载体可显著提高药物的透皮性，然而纳米悬浮液的稳定性问题一直是目前研究的关键。Zhang等[27]认为蔗糖酯(SE)可以改善纳米悬浮液的稳定性，并探究了不同酯化程度的SE对EGCG纳米悬浮液稳定性影响情况，发现酯化的SE可提高纳米悬浮液的ZeTa电位，从而改善其物理稳定性，酯化程度越高，ZeTa电位越大。以高度酯化的棕榈蔗糖酯(PSE)作为稳定剂制备的EGCG纳米粒悬浮液表现出高稳定性，并且其抗UVB引起的皮肤损伤比天然的EGCG效果更优。

1.2 壳聚糖

壳聚糖具有良好的生物相容性、微生物降解性、安全无毒等优良性能[28-29]，其分子表面丰富的功能基团可与粘液中的糖蛋白形成氢键，吸附到黏膜表面，延长被包封药物或活性物质在人体肠道中的保留时间，持续释放，提高被包封物质的生物利用度[30-31]。壳聚糖纳米粒子诸多优良特性使之成为理想的口服递送载体[32-33]，壳聚糖纳米粒子包封茶多酚常用自主装和离子凝胶化两类方法[34]。张茵等[35]通过自主装法制备茶多酚-明胶-壳聚糖(TP-Gel-Cs)纳米粒，在最优条件下制备的纳米粒平均粒径971.5 nm，分散指数0.22，载药量为26.82%，包封率为90.42%。该纳米粒能够保护茶多酚，提高其在空气中的稳定性。模拟口腔环境，发现TP-Gel-Cs纳米粒能够缓慢释放，并且具有一定的生物黏附性。Zou[36]等采用层层自主装法将EGCG包埋在涂覆有葡聚糖硫酸盐的壳聚糖纳米粒(100～200 nm)中，包封率高达90%～95%，24 h内累积释放量达70%，可大大减缓EGCG在胃肠道中的降解速度。Liang等[37]以叶酸改性羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐为壁材，通过离子凝胶化方法制备纳米茶多酚，所制备的纳米茶多酚显示了较强的缓释性能，在pH为7.4的PBS缓冲溶液中纳米粒的体外释放时间可长达48 h。Liang等[38]以玉米醇溶蛋白涂覆壳聚糖纳米粒子负载EGCG成功制备了zein/CS-NPs纳米粒，玉米醇溶蛋白的使用，显著降低了壳聚糖纳米粒的粒径，提高ZeTa电位，大大提高纳米粒的控释性能和EGCG的抗氧化活性。

1.3 蛋白质

蛋白质具有生物相容性、可降解性、低毒、价格低廉等优点，被广泛应用于纳米胶囊领域[39]。乳球蛋白、酪蛋白、明胶、大豆蛋白等都是常用的蛋白质载体材料，其中以β-乳球蛋白应用最为广泛[40]。β-乳球蛋白是反刍动物乳清蛋白的主要成分，其水解产生的蛋白肽具有杀菌、降低胆固醇、抑制血管紧张素转换酶活性等[41]。β-乳球蛋白是一类高度结构化的蛋白质，具有较强的配体结合能力，能与茶多酚以多种方式结合[42]。黄美蓉等[43]采用热诱导法制备的EGCG-Vc-β-乳球蛋白纳米，能更好的保护EGCG的活性。杜文凯[41]以β-乳球蛋白为纳米载体包埋EGCG，当溶液pH为6.4～7.0，热激温度为70～85℃，所制备的纳米粒粒径小(<10 nm)、体系稳定(Zeta电位<-30 mV)、包埋率高(>5%)，所制备纳米粒能更好控制EGCG的释放。祖元刚等[44]采用去溶剂法制备叶酸介导的EGCG白蛋白纳米粒(FA-EGCG-BSANP)，平均粒径为200 nm，EGCG的包封率可达(81.5±1.8)%，载药量为(29.3±0.6)%，制备的纳米粒能显著提高EGCG对前列腺癌细胞(PC-3)的靶向效果。近年来，学者们通过化学修饰手段提高β-乳球蛋白(β-LG)与多酚的亲和度，从而提高茶多酚的活性。例如，Wu等[45]将β-LG进行热修饰后共组装制备β-LG-EGCG(Eβ-NPs)纳米粒，热改性的β-LG与EGCG的酚羟基通过氢键结合，使EGCG与热修饰的β-LG的亲和力大于未修饰的β-LG。以热改性的β-LG包裹的EGCG显著提高对癌细胞的抑制作用，Eβ-NPs对试验中的11种癌细胞系的生长抑制作用均显著高于单纯的EGCG，并且对正常细胞无毒副作用。Yang等[46]以3-巯基-1-己醇(3MH)作为稳定剂，将热修饰的β-LG与EGCG通过共组装方法制备MEβ-NPs纳米粒。受3MH的保护，MEβ-NPs纳米粒中EGCG的抗氧化活性比β-NPs和单纯的EGCG活性都更高，稳定性更好。Fan等[47]通过自由基诱导接枝方法将β-乳球蛋白(β-BLG)与氯原酸(CA)共轭耦联制备β-LG-CA-EGCG缀合物，研究发现，CA能保护β-LG免受消化酶影响，且热处理后的β-LG与CA共轭耦联，使蛋白质暴露出更多的疏水基团，EGCG中更多的基团与β-LG相结合，从而EGCG在β-LG-CA纳米颗粒中的化学稳定性显著高于β-LG。β-LG-CA纳米粒中释放的EGCG比β-LG更缓慢，β-LG-CA共轭耦联后DPPH清除力显著提高，且随着CA浓度增加，DPPH自由基清除能力提高。

1.4 其他

金属纳米粒子是指在形态上被缩小至纳米程度(5～100 nm)的金属颗粒，这种新型纳米材料表面可以引入很多特殊功能的基团，进行功能化修饰。金纳米药物载体除了可以提高被包封药物的生物活性，其材料本身还具有清除自由基的能力[48]，10 nm以下的金纳米可以在血管中自由流动，将之注入到血液中输送到人体各个部位，可作为监测和诊断疾病的手段[49]。Mukherje等[50]采用绿色纳米技术一步合成绿茶多酚-金纳米粒(直径<50 nm)，其纳米粒表现出卓越的稳定性。Yuan等[51]使用岩藻糖-羧甲基壳聚糖(FU-CMC)与金纳米粒接枝制备FU-CMC-EGCG-GNPs纳米粒，显著提高EGCG的生物利用度。变性淀粉在提高药物稳定性方面表现出良好的应用前景，其来源广泛，能够稳定供给并且价格便宜、无毒无味，常被作为口服制剂的壁材[52]。多孔二氧化硅是一类很有前途的新型载体材料，具有巨大的比表面积和体积，负载量大，易于表面功能化，还具有尺寸和孔径可调的优点，可控制药物释放速度等[53-55]。许多文献报道[56-58]以多孔二氧化硅成功包埋布洛芬、紫杉醇、姜黄素等药物并表现出卓越的疗效潜力，然而目前还未发现以上述材料包封茶多酚的报道，未来可致力于多孔二氧化硅包埋茶多酚的相关研究。

2 茶多酚纳米颗粒的药理活性研究

茶多酚不稳定，易受温度、光、氧、pH等因素影响，发生氧化、聚合和缩合等反应，改变了其原有的结构和活性，从而失去其功效[59]。有研究表明，茶多酚口服后利用度不超过5%[60]，且易在胃肠环境中发生降解和聚合、易发生甲基化、硫酸化、葡萄糖醛酸化等生物转化、易受体内酶和其他营养成分的影响，从而无法充分发挥其功效[61]。茶多酚中生物活性最高的EGCG在血液环境(pH=7.4)也很不稳定，到达作用靶点前已发生降解。因此，茶多酚的纳米包埋技术，成为其生物学活性高表达的一条有效途径。

2.1 抗氧化

刘珍[25]制备的壳聚糖-脂质体-茶多酚(CH-TP)纳米粒和二氧化硅-壳聚糖-脂质体-茶多酚(S-CH-TPN)纳米粒的DPPH自由基清除能力较单纯茶多酚均显著增强。杜文凯[41]以β-乳球蛋白作为纳米载体包埋茶多酚，能较好保护茶多酚的抗氧化活性，延缓其抗氧化活性的降低。Bao等[62]制备了茶多酚-壳聚糖纳米粒的抗氧化明胶膜，结果发现在贮藏期间，实现了明胶膜中茶多酚的释放，显著提高了明胶膜的自由基清除活性，延长了抗氧化时间。Xiang等[63]通过一种“绿色”化学合成途径制备一系列不同粒径的茶多酚纳米粒，这些纳米粒由于壁材的保护，DPPH清除率均显著提高。李乙文等[64]发明一种抗氧化聚茶多酚纳米材料，所制备的纳米粒(100～300 nm)是以茶多酚和茶碱为原料，不添加其他外源添加剂，且该纳米材料在清除自由基方面表现优异，有望作为绿色抗氧药物和安全无毒的食品添加剂。Kulandaivelu[65]等以明胶包封茶多酚制备了茶多酚纳米粒，可以延长茶多酚的作用时间，改善茶多酚的生物利用度。综合来看，茶多酚纳米颗粒提高抗氧化活性表达可归结为两方面：其一是纳米颗粒形成粗糙的疏水核或特殊网络结构，限制了茶多酚的迁移，实现了茶多酚的缓慢释放，延长了抗氧化时间，从而提高抗氧化活性；其二是形成聚合物壁，将茶多酚包裹在内部，降低茶多酚的氧化降解速率，从而达到保护茶多酚的效果。

2.2 抗肿瘤

茶多酚在体外模型、动物模型的多个癌症位点研究中均被证实具有抗癌活性。它通过改变癌细胞的氧化还原状态，抑制癌细胞生长，引发癌细胞凋亡，同时凭借其抗氧化性使正常细胞免受损伤。然而由于茶多酚在胃肠环境中极不稳定，生物利用度低，低剂量的药物浓度无法达到抗癌效果。目前体内外的抗癌研究所用的茶多酚浓度高达10～200 μM，而这个浓度远高于药物水平[13]。另一方面，小肠上皮细胞缺少特殊的受体将茶多酚带入细胞，限制了细胞对茶多酚的摄取。通过纳米包埋手段，可以克服茶多酚的不稳定性、肠道运输不良、吸收率低等问题。纳米介导递送系统确保了茶多酚在胃肠条件下的物理稳定性、靶向性、缓释性，增加了细胞对茶多酚的摄取从而提高茶多酚的生物利用度，实现了低剂量的药物浓度即可达到抗癌效果。

Siddiqui等[66]研究发现载有EGCG的壳聚糖纳米粒子能显著诱导人类黑素瘤Mel928细胞的凋亡和抑制细胞增值，在小鼠模型中也证实其抗癌活性，并且该纳米制剂比单纯使用EGCG的抗癌效果高出8倍。Liang等[37]以肿瘤细胞HepG2为细胞模型，以移植瘤H22小鼠为动物模型，探讨叶酸改性羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐制备的纳米茶多酚的抗肿瘤效果，研究发现，该纳米粒在体内外均有较强的抗肿瘤效果，对表面具有大量叶酸受体的癌细胞具有更强的肿瘤抑制作用。张昀[67]在杜文凯及其他实验室成员的研究基础上，以β-乳球蛋白作为纳米载体，釆用热诱导法制备了4种EGCG-β-乳球蛋白纳米粒(20～30 nm)，采用MTT法研究了4种纳米粒在不同浓度和不同时间下对人体黑色素瘤细胞(A375)、人肺腺癌细胞(SPC-A-1)、人宫颈癌细胞(Hela)、人结直肠癌细胞(CaCao-2)等14种肿瘤细胞活性抑制效果，结果显示，这些纳米粒均比单纯的EGCG有更强的抗肿瘤活性。祖元刚等[44]制备叶酸介导的EGCG白蛋白纳米粒(FA-EGCG-BSANP)，显著提高了EGCG对前列腺癌细胞(PC-3)的致死作用，同等浓度下FA-EGCG-BSANP对PC-3细胞的抑制率为82.8%，而EGCG溶液为58.6%。

纳米包埋可以提高EGCG的稳定性，而近来的研究又发现EGCG可以提高纳米粒的稳定性，以EGCG-纳米颗粒作为药物载体具有很大的发展前景。Liao等[68]分别以EGCG-纳米粒和普通纳米粒负载多西紫杉醇(DT)，发现嫁接有EGCG的纳米颗粒比普通纳米粒稳定性更高，外观更平滑，结构更紧凑。纳米粒嫁接EGCG后可显著提高DT药物的透皮性，EGCG-纳米粒和普通-纳米粒负载DT后对A-375人黑素瘤细胞的肿瘤抑制率分别为92.25%、73.2%。Zhang等[69]以茶多酚纳米粒负载阿霉素，提高阿霉素在肿瘤部位的有效积累，以茶多酚构建的纳米粒装载药物可同时发挥药物和茶多酚的功能，从而提高茶多酚和所载药物的生物利用度。学者们在研究了茶多酚纳米粒的抗肿瘤效果的基础上，又进一步探究了其抗肿瘤机制。Wu等[70]探究了Eβ-NPs纳米粒诱导癌细胞凋亡机制，研究发现，Akt蛋白质发挥了关键作用，通过降低Akt磷酸化水平，影响促凋亡蛋白或抗凋亡蛋白的表达。Eβ-NPs比单纯的EGCG更有效的介导Akt活化水平的降低，促进Capase-3、Capase-9裂解，降低Bcl-2基因表达，提高Bax基因表达，从而阻断肿瘤抗凋亡信号通路，此外Akt活化减少也引起了p21蛋白上调，进一步抑制cyclin E蛋白和CDK蛋白的表达，导致细胞周期停滞和细胞增殖减少。

2.3 抗菌抗炎

Zhang等[71]通过离子凝胶技术包裹儿茶素(CAT)或儿茶素-Zn复合物(CAT-Zn)制备不同粒径的β-壳聚糖纳米粒子(β-CS)并评价其抗菌活性。研究表明，相比于未包裹的CAT和CAT-Zn，β-CS包裹的CAT(β-CS-CAT)或CAT-Zn(β-CS-CAT- Zn)具有更强的抗菌活性，并且粒径越小的纳米粒抗菌活性越好。β-CS-CAT-Zn的抗菌活性优于β-CS-CAT，前者对乳杆菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为0.031和0.063 mg·mL-1以及0.063和0.125 mg·mL-1。Lin等[72]研究发现，游离的EGCG稳定性差，常常无法到达抗菌活性的目标位置就已发生降解，而制备的岩藻糖-壳聚糖/明胶-EGCG纳米粒，有良好的靶向作用，可直接作用于幽门螺旋杆菌感染部位的细胞，对幽门螺杆菌有显著的清除效果，并可有效减少该菌引起的胃窦炎。侯绍云[73]以壳聚糖(CS)和聚天冬胺酸(PAA)作为纳米载体装载茶多酚(TP)，所制备的TP-CS-PAA纳米粒对三隔镰孢菌、尖孢炭疽菌、互隔交链孢霉、可可毛色二孢菌、葡萄座腔菌5种病原真菌的菌丝生长和孢子萌发均有抑制作用，且抑制作用与浓度呈正相关。相同浓度下，TP-CS-PAA纳米粒对病原真菌的抑制效果显著优于单纯茶多酚，TP-CS-PAA纳米粒对上述5种病原真菌菌丝生长抑制的有效中浓度EC50分别为0.220、0.437、0.235、0.171、0.190，而非纳米粒的有效中浓度EC50依次为0.337、0.608、0.321、0.282、0.299。

2.4 其他

Smith[74]等在小鼠试验中发现，EGCG纳米脂质的体内口服利用度比游离EGCG提高2倍，包封的EGCG可使诱导神经元SweAPP N2a细胞产生α-分泌酶的能力提高91%，促进淀粉样前体蛋白(APP)的非淀粉样蛋白合成，防止脑β-淀粉样斑块形成，从而提高阿尔茨海默病和HIV相关性痴呆的治疗效果。Kumar等[75]给试验小鼠喂食壳聚糖-茶多酚纳米制剂，3天后将之暴露在辐射环境，发现封装的茶多酚比单纯的茶多酚显示出更高的防辐射效力，降低了辐射诱导的致死率。张俊等[76]利用茶多酚作为还原剂和稳定剂制备纳米银，所得茶多酚纳米银溶液对直接蓝15(一种染料)的催化降解率高达91%，而没加茶多酚纳米银，相同时间内直接蓝15的降解率仅有35%。Zheng等[77]以壳聚糖-酪蛋白磷酸肽(CS-CPP)包埋甲基化的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG3”Me)，所制备的CS-CPP-EGCG3”Me纳米粒可明显改善EGCG3”Me生物活性并显示出良好的抗肥胖作用和肠道微生物菌群调节作用。Zhang等[78]在EGCG纳米粒表面靶向结合CD36受体，所制备的纳米粒表面的CD36受体能有效的将EGCG递送至巨噬细胞内，提高巨噬细胞对EGCG的亲和力和摄取，从而提高EGCG的抗动脉粥样硬化活性。

3 展望

纳米材料因其特有的小尺寸效应和量子效应，已在医药、食品及化妆品领域中展现出广阔的应用前景。采用纳米技术包埋茶多酚可保护其免受外界环境或胃肠道中氧化、降解，提高其稳定性，且在提高茶多酚生物利用度、缓释、靶向效应等方面具有独特的优势，然而茶多酚纳米粒想要从实验室到实际应用还需要进一步的研究。

(1)纳米包埋技术在提高茶多酚稳定性和生物利用度已取得较大进展，然而各载体材料均存在一定的缺陷。脂质体生产重现性差、贮存稳定性欠佳、包封率低、在体外被包埋物易于从脂质体中渗漏，或在体内未到达靶组织，脂质体就发生渗漏；壳聚糖分子中存在氨基和羟基等官能团，易受到体系酸碱性的干扰，不能在相对酸性的环境下存在；金纳米制备成本高、产率产量低；无机材料在安全性、质量评价等方面仍面临着较多问题。(2)茶多酚纳米粒的生物活性与药物水平尚有一定差距。(3)已有的细胞和动物试验结果尚缺乏临床试验验证。人体环境复杂，离子、pH、胃肠道中的消化酶和粘液层等因素，均会影响纳米粒子递送系统的稳定性，体外细胞模型以及体内动物模型的结果不能代表人体疗效，需要进行临床试验验证。未来研究可以从以下几方面入手：(1)通过功能团修饰提高壁材的稳定性；(2)挖掘开发新的载体材料；(3)开发适于口服给药的茶多酚纳米制剂；(4)在体内外试验已取得进展的茶多酚纳米制剂，需进行系统的毒性验证，并进行临床试验。