配合饲料中黄曲霉毒素毒害及其检测技术研究进展

■职爱民孙 勇

（1.郑州工程技术学院化工食品学院，河南郑州450002；2.焦作百奥泰克生物科技有限公司，河南焦作454991）

黄曲霉毒素（aflatoxins，AFs）是一类二呋喃香豆素衍生物，目前已发现的有20种，主要由黄曲霉（As⁃pergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等霉菌产生。自然条件下产生的AFs主要包括AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，其中AFB1毒性最强，污染最广[3]。AFs几乎可以对任何动物产生毒性作用，尤其是雏鸭最为敏感[4]。AFs极易污染花生、玉米、稻米、小麦、大豆等饲料原料，对动物配合饲料的卫生指标造成了极大的威胁。根据最新国家标准《GB 13078—2017饲料卫生标准》中对雏鸭浓缩饲料或配合饲料中AFB1的限量标准为10 μg/kg，其他鸭饲料中AFB1的限量标准为15 μg/kg。

1 黄曲霉毒素的分类产生

1.1 黄曲霉毒素的分类

根据农作物感染霉菌的时间可将AFs分为田间毒素和仓储毒素。

田间毒素是指农作物从种子形成、收获晾晒到运输入库感染霉菌所产生的毒素。此类霉菌的感染多为自然环境所致，包括收获前土壤干旱贫瘠、作物受到大面积物理损伤、病虫灾害、不能适时采收、采收前后大雨等。

仓储毒素是指农作物在储存过程中感染霉菌所产生的毒素。此类霉菌污染多受人为因素影响，包括入仓时作物水分较高、储存环境潮湿、储存温度较高、通风较差等。

1.2 黄曲霉毒素的产生

温度和湿度对AFs的产生影响最为显著，其最佳产毒温度为25～30℃，适宜湿度为85%，并且随着温度的升高，黄曲霉的产毒能力逐渐下降。当温度达到36℃以上时，产毒即被抑制[5-6]。AFs的生物合成过程极为复杂，涉及到至少17种不同的酶参与合成反应[7]。其中多个酶基因已被克隆，包括均存在于黄曲霉和寄生曲霉的克隆基因nor-1、aflR、ver-1、ord-1、ord-2和omt-A；以及只存在于寄生曲霉的克隆基因pksA、uvm8 和 aad[8]。Price等[9]对比研究了温度、pH值、氮源和碳源对AFs通路特定基因转录的影响，发现温度对其影响最大。

2 黄曲霉毒素的危害

2.1 黄曲霉毒素对饲料及原料的污染

2017年上半年，刘凤芝等[13]采用ELISA结合HPLC对我国部分地区饲料及原料共356份样品进行了AFB1的检测，检出率为87.8%，平均含量为11.2 μg/kg，主要存在于粕类中。2016年，周建川等[14]采用免疫亲和柱-高效液相色谱法对国内各省的饲料及原料共1 304份样品进行了AFB1的检测，检出率为92.14%，各种类样品超标率平均为31.5%，其中粕类超标率最高为81.48%。2015年，黄俊恒等[15]对我国19个省区的饲料及原料共944份样品进行了AFB1的检测，整体超标率仅为2.7%，主要是个别花生饼、花生粕样品受到严重污染。2014年，刘凤芝等[16]对来自全国的602份样品进行了AFB1的ELISA检测，检出率最高的为玉米，达95.12%，其次是粕类，达38.89%。

从近几年AFs污染的情况来看，其污染范围非常广，但污染程度与原料种类和每年气候环境有很大关系。主要污染原料是玉米及其副产品、花生及其副产品和其他杂粕类原料。

2.2 黄曲霉毒素对鸭的影响

AFs会导致鸭的采食量下降，料肉比降低，蛋鸭产蛋下降，经济效益降低。同时会对鸭产生较大的毒性作用，比如肝脏毒性、免疫毒性、神经毒性和生殖毒性等。AFB1是迄今为止发现的最强的致肝癌物质之一，致病鸭往往肝脏肿大，呈土黄色，质地变脆，有出血点[17]；AFs对鸭具有明显的免疫抑制作用，每天采食10 μg/kg就会导致成年鸭免疫器官中的淋巴细胞数量减少[18]；黄曲霉毒素中毒的鸭往往伴随着腿软不能站立或跛行，角弓反张等神经症状[19]；AFs还可造成公鸭睾丸生殖上皮发生明显病变，睾丸萎缩变轻，少精，引起繁殖能力和受精率下降等[20]。

3 黄曲霉毒素的检测方法

目前，对于AFs的检测方法可分为理化检测法和免疫学检测法。其中理化检测法以薄层层析法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法为代表；免疫学检测法以酶联免疫吸附法、免疫层析法、荧光偏振免疫分析法、时间分辨荧光免疫分析法和免疫传感器法为主。

3.1 理化检测法

3.1.1 薄层层析法

薄层层析法（thin layer chromatography,TLC）是最早的检测AFs的方法之一，而且还是我国现行国家标准（GB/T 5009.23—2006）中的推荐方法之一。其原理是将样品提取、浓缩、薄层分离后，在365 nm的紫外光照射下，B族黄曲霉毒素产生蓝紫光，G族黄曲霉毒素产生绿光，然后根据荧光强度来测定毒素含量。王雄等[21]采用TLC法通过研究pH值、NaCl含量、油脂含量、蔗糖含量和芦丁含量等因素对测定苦荞中AFB1的影响，最终得到最佳检测条件。该方法的优点是设备简单，操作方便，分析成本低；缺点是重复性差，准确度较低且不能区分同族的AFs。

3.1.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法（high performance liquid chro⁃matography，HPLC）也是目前定量检测AFs的国标方法之一。其原理是在适宜的流动相条件下，采用固相萃取住，使AFs得到分离，通过测量色谱峰面积计算毒素含量。孟之航等[22]采用HPLC法对市售玉米制品、坚果制品中的4种AFs进行检测。结果显示，玉米制品的阳性率为36%，坚果制品中未检出。该方法的优点是准确度高，检出限低，重复性好，可同时测定不同种类的AFs；缺点是前处理复杂，分析成本昂贵，对操作人员要求较高。

5.5 鼓励企业提高科研投入 通过科研项目引导企业提升自主创新能力，通过税收、中小企业研发基金等政策增加企业自身科研投入。组织工业领域，甚至军工领域从材料、工艺、设计研究单位、转制企业等方面，共同针对关键技术持续集中攻关，并形成市场化供应能力。

3.1.3 液相色谱-质谱联用法

液相色谱-质谱联用法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS）结合了液相色谱的高效分离效能和质谱技术的高灵敏度、高选择性特点，是目前检测AFs最具权威性的检测技术。李洪波等[23]建立了高效液相色谱-串联质谱法同时测定玉米中AFB1和三种除草剂农药残留的新方法。结果表明，AFs在不同玉米样品中的检测限为0.5 μg/kg，在0.2～5.0 ng/ml范围内线性关系良好。虽然此方法优势巨大，但其设备操作复杂、仪器成本高等缺点始终阻碍着该方法的普及应用。

3.2 免疫学检测法

3.2.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）检测小分子半抗原时根据包被抗原或抗体可分为间接竞争ELISA和直接竞争ELISA。其检测原理是将抗原(或抗体)包被于酶标板，同时加入抗体与待测半抗原(或酶标半抗原与待测半抗原)，抗原与待测半抗原(或酶标半抗原与待测半抗原)共同竞争抗体的抗原结合位点，洗板后酶标板上仅留下抗原与抗体(或酶标半抗原与抗体)反应结合的抗原抗体复合物，复合物的量与待测半抗原的量呈负相关，通过酶底物催化显色，根据颜色的深浅对待测半抗原进行定性或定量检测。孙清[24]建立了检测玉米、豆粕及鱼粉中AFB1的直接竞争ELISA，IC50为66 pg/ml，线性范围为10～810 pg/ml，检测结果与HPLC-MS/MS结果相符。该方法由于在灵敏性、特异性、准确性、稳定性和适用性等方面表现良好，因此也是我国国标（GB/T 17480—2008）中测定饲料AFB1的方法之一。

3.2.2 免疫层析法

免疫层析法（immunochromatographic assay,ICA）的检测原理是待检样品溶液在虹吸作用下从测试端向手柄端侧向流动，待检靶标在侧向流动过程中与结合垫和层析膜上的生物活性材料先后发生特异性结合，并在层析膜上形成检测线和质控线。因其具有“快速、特异、敏感、简便、低成本”等优势，在AFs的现场快速检测中应用十分广泛。Liu等[25]建立了快速灵敏的胶体金免疫层析试纸检测方法用于检测AFB1，灵敏度高达1.0 ng/ml。Masinde等[26]开发了一种简单快速的免疫层析试纸条用于同时定量测定玉米和水稻中AFB1和AFB2，目测检测限均为0.1 ng/ml，但与AFG1、AFG2有交叉反应性。肖理文等[27]成功研发了一种基于时间分辨荧光纳米微球的AFB1快速定量检测试纸条，最低检出限为0.29 μg/kg，线性范围为1.00～50.00 μg/kg，添加回收率为92.87%～121.33%。任美玲[28]将量子点荧光微球作为标记探针偶联AFB1腹水单克隆抗体制备免疫层析试纸条，IC50为(13.87±1.54)pg/ml，定量检测范围为5～60 pg/ml，表明该荧光试纸条具有较好的检测性能。近年来随着越来越多的纳米标记材料问世，该技术领域将向着高敏感、高通量、数字化的方向发展。

3.2.3 荧光偏振免疫分析法

荧光偏振免疫分析法（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）是用荧光物质标记抗原或抗体与待检样品中抗原共同竞争结合抗体，依据抗原抗体结合物荧光偏振程度的差异，检测待检样品中AFs含量。Sheng等[29]采用新型荧光标记物标记抗AFB1单克隆抗体建立FPIA，对AFB1的IC50为23.33 ng/ml，检测限为13.12 ng/ml。杨晓涵等[30]利用FPIA检测药茶中AFs含量，结果表明，检测限为20 ng/ml，检测范围为92.76～252.32 ng/ml。该方法虽然速度快、操作简便、可高通量，但是由于基质效应易有假阳性，而且荧光偏振设备昂贵。

3.2.4 时间分辨荧光免疫分析法

时间分辨荧光免疫分析法（time resolved fluoro⁃immunoassay,TRFIA）是使用镧系元素为长寿命荧光标记物，利用时间分辨分析仪，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光。樊晓博[31]建立的用于检测大米、花生、黄豆和干果中AFB1的直接竞争时间分辨免疫检测方法，灵敏度为0.02 ng/ml，IC50为0.73 ng/ml。Huang等[32]建立了用于同时定量测定AFB1和OTA的双标记TRFIA，其中对AFB1的灵敏度是0.02 ng/ml，检测范围为0.02～100 ng/ml。该方法能够很好的消除背景荧光干扰，灵敏度高出普通荧光几个数量级，同时克服了放射性同位素带来的污染问题，在免疫分析中有较大的发展潜力。

3.2.5 免疫传感器法

免疫传感器法（immunosensor，IS）是待测样品中抗原与固化在传感器表而的特异性抗体反应形成抗原抗体结合物，结合物量的大小决定IS的电荷信号，换能器根据电荷信号的强弱变化，达到检测待检抗原的目的。IS根据传感技术原理可分为光学免疫传感器、电化学免疫传感器、热量免疫传感器和质量免疫传感器4类。Sharma等[33]将抗AFB1抗体固定在金纳米粒子和3，4-亚乙基二氧噻吩上，以此作为生物电极制备电化学免疫传感器，对玉米中AFB1进行检测，最低检出限为 0.004 5 ng/ml，线性范围为 1～25 ng/ml。王瑞鑫等[34]采用壳聚糖、石墨烯和1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐复合膜修饰玻碳电极，包埋固定抗AFB1抗体，构建了一种免疫传感器，用于快速测定花生和玉米油中的AFB1，检出限为0.04 ng/ml，回收率为94.73%～104.41%。此类方法操作简单、灵敏度极高，但目前抗原抗体的固化技术还不够成熟，研究较少。

4 黄曲霉毒素的脱毒技术

根据目前应用于动物配合饲料及原料中AFs的脱毒方式可分为吸附式脱毒和酶解式脱毒两种。

4.1 吸附式脱毒

添加毒素吸附剂是最有效、可行、低成本的去除AFs的方法，包括铝硅酸盐类（如蒙脱石、沸石、硅藻土、膨润土）和酵母细胞提取物类（如甘露聚糖）。钱潘攀等[35]利用麝香草酚裂解酵母细胞，同时以酵母膜脂为载体，与细胞壁共同组成具备抑制黄曲霉孢子萌发和吸附毒素能力的双效型细胞壁提取物，结果表明，对AFs的吸附能力达到2.5 μg/mg，对麝香草酚的载药量达到41.5 μg/mg。马文文等[36]选用6种有机季铵盐对钠基蒙脱土（Na-MMT）进行改性，并对其脱除花生油中AFB1的条件进行优化。结果表明，用十八烷基三甲基氯化铵（1831）改性后的Na-MMT脱毒效果最佳，花生油中AFB1含量从(29.20±2.12)μg/kg降低到(4.47±0.29)μg/kg，脱毒率84.69%。虽然毒素吸附剂对于毒素的脱毒简单有效，但是其对饲料中营养物质的吸附以及二次污染问题一直是人们担心的重点。

4.2 酶解式脱毒

利用微生物产生的酶来降解AFs是目前科研人员研究的热点。这种脱毒方法具有安全环保、解毒彻底、专一性强和不影响饲料营养价值等优点。Sangare等[37]筛选出铜绿假单胞菌N17-1，对AFB1、AFB2和AFM1的降解率分别为82.8%、46.8%和31.9%，并证实起作用的为耐高温的蛋白酶。Motomura等[38]从平菇中提取并纯化了1种通过裂解AFB1的苯环来达到脱毒效果的胞外酶。Xu等[39]从沙氏芽孢杆菌L7中分离得到一种超氧化物歧化酶，该酶对AFB1、AFB2和AFM1的降解率分别为92.1%、84.1%和91.4%。在此基础上，研究人员开始利用基因工程技术对活性高的解毒酶基因进行克隆，实现解毒酶基因在原核或真核工程菌中的高效表达，为AFs的脱毒开辟了新的思路。

5 展望

黄曲霉毒素自1960年被发现后开始进入人们的视野，其对我国动物配合饲料的危害程度不言而喻。那么如何有效的对AFs进行防控是动物饲料行业必须认真考虑的问题。作者认为应从以下几个方面考虑。

首先，原料的接收标准应重点考虑到水分和AFs的含量，对原料中AFs的检测是必不可少的；其次，原料仓储环境要通风干燥，避免仓储毒素的产生；最后，通过添加脱霉剂降低原料或饲料中的AFs对动物的机体危害；另外，可根据当年全国气候变化以及各区域毒素分布情况，对原料进行地区针对性的采购。