与肝纤维化相关的长链非编码RNA的研究进展

胡存梁，陈尼维

(上海交通大学附属第六人民医院，上海 200233)

肝纤维化是肝脏组织损伤后修复失调的结果，其病理特征是细胞外基质过度沉积[1～3]。各种原因所致的慢性肝损伤，导致肝星状细胞(HSC)被活化并转分化为肌成纤维样细胞，分泌大量细胞外基质，包括α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α1(COL1α1)，并释放促炎因子和促纤维化因子[4～6]。其中转化生长因子β1(TGF-β1)是主要的促纤维化因子，TGF-β-Smad信号通路是调控肝纤维化的重要细胞内信号通路，参与肝纤维化的发生发展[7,8]。长链非编码RNA(lncRNA)是指分子量大于200个核苷酸的RNA，能通过多种途径调控基因表达，参与染色体重塑、转录及转录后等过程[9]。lncRNA表达异常参与多种疾病的发生发展，尤其是在器官纤维化、肿瘤方面[10～14]。本文对lncRNA与肝纤维化关系的研究进展进行综述。

1 促肝纤维化lncRNA

1.1 Alu介导的p21转录调节因子(APTR) p21基因位于染色体6p21.2，其编码的蛋白p21是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子，具有抑制细胞周期和细胞增殖的作用，而APTR内辅助元件Alu是APTR结合到p21所必须的。Yu等[15]研究发现，APTR在人、小鼠纤维化肝组织以及活化的HSCs中表达上调。敲除APTR基因能够抑制体外培养的HSC活化，且能减轻体内胶原蛋白(α-SMA、COL1α1)的堆积。另外，敲除APTR基因能够增加HSC内p21表达，从而抑制细胞周期和细胞增殖，导入p21 siRNA1至HSC能够减弱这一抑制作用。进一步研究发现，p21在肝纤维化模型中表达下调，且其表达随APTR表达增加而下降，APTR能招募多梳抑制复合物2(PRC2)结合到p21启动子，从而抑制p21表达，最终抑制HSC活化与增殖[16]。肝纤维化患者血清APTR水平升高，提示APTR是诊断和治疗肝纤维化的潜在标志物。

1.2 由TGF-β激活的lncRNA(lncRNA-ATB) lncRNA-ATB是TGF-β信号通路的重要调节因子。在丙型肝炎病毒(HCV)相关肝纤维化患者的肝脏组织、血清及HSC中lncRNA-ATB水平均上调，敲除HSC中lncRNA-ATB基因能抑制HSC活化(α-SMA和COL1α1表达减少)[17,18]。lncRNA-ATB作为竞争性内源RNA(ceRNA)可促进HCV相关肝纤维化，作用机制主要包括以下几点。首先，lncRNA-ATB能竞争性结合miR-425-5p，抑制miR-425-5p，进而在转录后水平抑制靶基因TGF-β RⅡ和SMAD2表达，激活TGF-β信号通路，最终使HSC活化和增殖[17]；其次，在HCV相关肝纤维化患者肝脏组织及活化的HSC中miR-200a表达下降、β-连环蛋白(β-catenin)表达上调，当敲除lncRNA-ATB后，miR-200a表达上调、β-catenin表达下调，同时抑制人LX-2细胞(HSC细胞系)活化[18]。β-catenin是miR-200a的靶目标[19]，lncRNA-ATB作为ceRNA，与miR-200a结合使其不能抑制β-catenin表达，而β-catenin可促进细胞增殖和分化[20]。另外，HCV相关肝纤维化患者肝纤维化程度越严重，其血清lncRNA-ATB水平越高[17]。因此，lncRNA-ATB可能成为诊断和治疗HCV相关肝纤维化的靶标。

1.3 HOX转录反义RNA(Hotair) Bian等[21]研究发现，Hotair在小鼠肝纤维化模型、人纤维化肝脏组织、LX-2细胞中表达均显著增加。上调LX-2细胞中Hotair表达可抑制人母系表达基因3(MEG3)表达，并且促进LX-2细胞的增殖和活化，而抑制其表达则作用相反。究其原因，一方面，Hotair通过与miR-148b竞争性结合，使miR-148b不能抑制其靶基因DNA转甲基酶1(DNMT1)表达，导致DNMT1表达增加，DNMT1抑制MEG3、p53表达从而促进HSC增殖活化[22]。另一方面，Hotair能促进PRC2结合到MEG3启动子上，抑制MEG3表达，最终增加HSC活性[21]。上述结果提示，Hotair抑制物可能抑制肝纤维化的发生。

1.4 肝癌细胞中上调的lncRNA(HULC) T细胞参与肝脏发生炎症和纤维化的过程[23]。Zhao等[24]研究发现，乙肝相关肝硬化患者血浆中调节T细胞(Tregs)和HULC显著上调。通过慢病毒载体增加T细胞内HULC表达，能够使Tregs/T细胞比值增加，表明HULC能促进T细胞分化。进一步研究发现，HULC能够直接下调周期蛋白依赖激酶抑制剂p18水平，p18能够抑制T细胞增殖，p18基因丢失导致T细胞增殖增加。因此，HULC可能通过直接下调p18水平促进T细胞分化从而参与肝纤维化。

2 抗肝纤维化lncRNA

2.1 人母系表达基因3(MEG3) MEG3是一种印迹基因，位于14q32，该基因编码的lncRNA与多种人类癌症相关。He等[22]研究发现，肝纤维化时MEG3表达下降与其启动子发生超甲基化密切相关。MEG3表达水平在小鼠肝纤维化模型、人纤维化肝脏组织及LX-2细胞中均显著减少。对活化的LX-2细胞转染甲基化抑制剂5-azad C或小干扰RNA(siRNA)到DNMT1基因，抑制该酶表达，从而抑制启动子甲基化，导致MEG3表达显著增加、α-SMA和COL1α1表达减少、LX-2细胞增殖被抑制。另外，TGF-β1能使LX-2细胞增殖，而MEG3表达增加可激活p53，进而促进线粒体内细胞色素C释放至细胞质，使半胱天冬酶3活化，最终导致LX-2细胞凋亡，表明MEG3参与LX-2细胞凋亡。提示MEG3在HSC活化及肝纤维化进程中发挥重要作用。

2.2 生长停滞特异性转录本5(GAS5) GAS5最初是在生长抑制的鼠纤维原细胞中呈高表达而被发现，定位于人染色体1q25.1的小开放阅读框，全长630个核苷酸。Yu等[25]首次发现GAS5通过GAS5/miR-222/p27轴抑制HSC活化及增殖，从而参与抗肝纤维化。GAS5在小鼠、大鼠、人的纤维化肝组织及活化的HSC中表达下降。lncRNA作为ceRNA的特点主要包括：发生相互作用的lncRNA与miRNA主要存在于细胞质[26]；lncRNA的复制数目较miRNA多[27]。GAS5与miR-222之间的关系符合上述特点，因此认为GAS5是一种ceRNA。GAS5可竞争性结合miR-222，使miR-222表达减少，p27蛋白表达增加，而p27蛋白能够抑制细胞周期。肝纤维化时，GAS5表达下降，故miR-222表达增加，miR-222抑制p27表达，进而促进HSC活化及增殖。

2.3 基因间长链非编码RNA-p21(lincRNA-p21) lincRNA-p21在人、小鼠肝纤维化肝脏组织、HSC和HBV感染患者血清中表达均减少[28]。lincRNA-p21表达下降与其启动子甲基化有关。lincRNA-p21参与抗肝纤维化与多条信号通路相关。首先，lincRNA-p21作为ceRNA，与miR-181b竞争性结合，减弱miR-181b对PTEN表达的抑制作用，增强PTEN表达，最终抑制HSC活化。其次，miRNA调控的Wnt/β-catenin信号通路与HSC活化相关，过度表达lincRNA-p21能抑制HSC活化和Wnt/β-catenin信号通路，这一效应可完全被miR-17-5p抑制。因此，通过lincRNA-p21/miR-17-5p/β-catenin信号通路轴，lincRNA-p21能抑制HCS活化。故lincRNA-p21表达上调能够抑制HSC活化和增殖，甚至将HSC从活化状态逆转为静止状态，从而显著减少α-SMA和COL1α1水平，减轻肝纤维化的严重程度[28]。总之，lincRNA-p21调节HSC活化，其有可能成为肝纤维化治疗的新靶点。

3 lncRNA在肝纤维化诊断和治疗中的应用价值

在人体血清、血浆等体液中存在大量稳定的lncRNA，研究循环血lncRNA表达变化与肝纤维化发生发展的关系，是为了使用无创性诊疗手段辅助甚至代替目前的有创诊疗手段。HBV相关肝纤维化患者血清lncRNA-ATB水平越高、lincRNA-p21水平越低提示肝纤维化程度越严重。受试者工作特征(ROC)曲线分析表明，血清lincRNA-p21对肝纤维化的诊断具有100%的敏感性和70%的特异性。证实血清lncRNA水平可反映肝纤维化的严重程度；lncRNA是诊断肝纤维化的潜在标志物。

以往肝纤维化的治疗主要以抗纤维化药物为主，治疗效果不佳，长期服用易引发严重不良反应，且不能逆转肝纤维化。肝源难求及肝移植后的排异反应限制了肝移植的开展。越来越多的研究发现，肝纤维化时肝组织中异常表达的lncRNA参与了肝纤维化的发生。因lncRNA调控着大量的人类蛋白编码基因，所以可以选择特定的lncRNA干预其靶基因，从而调控肝纤维化的发生发展。理论上，lncRNA表达增加的肝纤维化，导入反义核苷酸下调lncRNA，恢复其正常调节水平可治疗肝纤维化；lncRNA表达下调的肝纤维化，将lncRNA导入体内，如通过慢病毒载体介导GAS5、lincRNA-p21转入目标体内可分别增加GAS5、lincRNA-p21表达，抑制肝纤维化发展。

目前动物和肝纤维化患者样本均显示lncRNA在肝纤维化中发挥作用，但其具体作用机制尚不明确。今后的研究将致力于寻找准确将lncRNA导入体内并使其充分发挥作用的方法；准确鉴定lncRNA的靶目标，并使导入体内的lncRNA作用于特定的与肝纤维化发病相关的靶目标。随着对lncRNA生理作用及其在肝纤维化发病中的作用机制的深入研究，通过调节肝纤维化患者体内lncRNA活性治疗肝纤维化有可能成为现实。