外泌体在肿瘤发生发展中的作用机制研究进展

臧明泉，任建琳，靖琳，陶灵佳，桂奕文，阎国良，李宁

(上海中医药大学附属市中医医院，上海200071)

外泌体是一种直径在30～150 nm的囊性小泡，人体几乎所有细胞都可以分泌外泌体。外泌体含多种功能性核酸和蛋白质，其物质转运和信息传递的功能影响细胞生长分化[1]，在多种疾病特别是肿瘤研究中逐渐成为热点[2,3]。肿瘤的生长涉及多种机制，包括血管新生、上皮间质转化(EMT)、化疗耐药、免疫逃逸、基质降解等[4]，相关外泌体研究均涉及上述机制[5]。此前诸多研究报道外泌体具有促进肿瘤进展的作用，随后外泌体抑制肿瘤生长和转移的作用被证实。探讨外泌体在肿瘤免疫调控、EMT、血管生成过程中的双重作用，有助于揭示和理解外泌体在肿瘤发生、进展中的复杂作用。现就相关研究进展综述如下。

1 外泌体在肿瘤免疫调控中的作用机制

体内免疫调节对清除肿瘤细胞、抑制肿瘤生长意义显著。多项研究表明外泌体参与了肿瘤细胞特异性识别、DC细胞抗原呈递、T细胞杀伤、细胞自噬的过程。

1.1 外泌体促瘤性免疫调控 骨髓衍生抑制细胞的生长受到骨髓基质细胞外泌体的影响。骨髓衍生抑制细胞在融合骨髓基质细胞外泌体后，信号通路中的STAT3和STAT1被激活，抗凋亡蛋白Bcl-xL、Mcl-1表达上调，且骨髓衍生抑制细胞释放NO增多，从而增强对T细胞的抑制[6]。卵巢癌源外泌体通过作用外周血中的淋巴细胞，调控其分泌的促炎因子、免疫刺激因子或免疫抑制因子水平，促进卵巢癌细胞免疫逃逸。Li等[7]将来源于卵巢癌和良性卵巢囊肿的外泌体分别添加到外周血淋巴细胞中，经检测发现有26种基因表达增高以及2种基因表达下调，26种表达增高的基因主要有促炎因子、免疫刺激因子、免疫抑制因子(如CCL2/4/5/18、CXCL1/2/5/8/10/11、IL1B/2/6/12A、VEGFA)，而表达下调的2种基因为抗原提呈基因HLA-A和HLA-B，这种外泌体介导的基因表达调控极有可能是通过激活干扰素和NF-κB信号通路实现的；随后研究者发现良性卵巢囊肿腹腔冲洗物相比卵巢癌患者恶性腹水来源的淋巴细胞核中P65和IRF5呈高表达。外泌体除了能够调节上述免疫因子外，还可抑制免疫性细胞毒性反应。通常上皮性卵巢癌生长受免疫性细胞毒性作用的抑制，该抑制途径包括NKG2D受体/配体通路和DNAM-1-PVR/nectin-2通路。有研究发现，上皮卵巢癌瘤体、上皮卵巢癌细胞系培养基上清液以及卵巢癌患者腹水来源的外泌体中NKG2D蛋白配体呈差异性表达，而DNAM-1配体含量较少；外周血单核细胞在获取卵巢癌来源的外泌体后其介导的细胞毒性反应被抑制，这主要是通过外泌体NKG2D蛋白配体与接受细胞中的相应受体反应；下调外周血单核细胞中的NKG2D受体蛋白表达，减弱该蛋白介导的细胞毒性，将使单核细胞对卵巢上皮细胞的杀伤力受到抑制[8]。

1.2 外泌体抑瘤性免疫调控 由于外泌体内容和功能通常受其来源细胞的影响，通过大量分离来源于T细胞又具有抗原识别功能的外泌体作用于肿瘤细胞从而发挥直接免疫攻击作用，这在肿瘤临床治疗相关研究中得到了广泛关注[9]。肿瘤细胞来源的外泌体承载母细胞癌性抗原这一特性是利用疫苗靶向作用抗癌的基础。Koyama等[10]将表达肺结核分歧杆菌的质粒导入黑色素瘤细胞株B16中，分离提纯既含有B16细胞致癌性又含有肺分歧杆菌抗原(早期分泌性抗原靶-6)的外泌体，将其注入到B16细胞移植瘤小鼠的足底，发现可加强小鼠体内对瘤体细胞和早期分泌性抗原靶-6的免疫反应；若将外泌体注入到小鼠瘤体内，瘤体生长受到显著抑制。在外泌体内含有足够多致癌性抗原的条件下，即使外泌体内不含主要组织相容性复合体Ⅰ分子亦不影响B淋巴细胞诱导效应T细胞[11]。来源于拓泊替康作用后乳腺癌细胞的外泌体内含有特异性DNA，这种特异性DNA可通过作用于STING蛋白(一种有利于激活免疫反应的天然免疫接头蛋白[12])介导树突状细胞激活，增强抗肿瘤免疫反应[13]。

2 外泌体在EMT中的作用机制

EMT是指上皮细胞完成具有侵袭和转移等间质细胞特性的转化，它是肿瘤细胞侵袭转移和远处播散的关键步骤之一[14]。外泌体通过调控Vimentin蛋白(EMT标志蛋白)影响受体细胞EMT而调节受体细胞侵袭转移。有学者[15]从晚期肺癌患者血清和高侵袭性肺癌细胞及低侵袭性肺癌细胞中分别分离提取外泌体，发现前两者源外泌体中Vimentin、N-cadherin蛋白高表达；将高侵袭性肺癌细胞株PC14HM及低侵袭性肺癌细胞株PC14源外泌体分别作用于正常支气管上皮细胞后，发现PC14HM细胞源外泌体作用的支气管上皮细胞的侵袭和迁移能力强于PC14细胞源外泌体作用的支气管上皮细胞，并且前者的Vimentin、N-cadherin蛋白表达更高；研究人员还发现与正常人相比肺癌患者血浆中外泌体Vimentin蛋白水平显著升高，并将外泌体对照组、外泌体Vimentin沉默组、siRNA阴性对照组的外泌体分别作用于人支气管上皮细胞，发现细胞迁移能力在Vimentin沉默组、siRNA阴性对照组、外泌体对照组依次增高，明确了肺癌细胞分泌的外泌体能够通过Vimentin蛋白促进EMT而促进侵袭转移[15]。

肿瘤成纤维细胞释放的外泌体被恶性细胞细胞摄取后，其EMT倾向显著增强[16]。来自T细胞的外泌体对放疗后人食管鳞状癌细胞株TE13的增殖和侵袭转移方面有着不一致的作用。TE13细胞在与T细胞来源外泌体共培养后，其增殖能力受到抑制，而侵袭迁移能力增强。研究人员提取受T细胞源外泌体影响后的TE13细胞中的蛋白，检测后发现与促进EMT相关的β-catenin、NF-κB及snail蛋白表达上调，即T细胞来源的外泌体可能是通过上调β-catenin/NF-κB/snail信号通路蛋白表达而促进TE13细胞EMT进而导致侵袭转移[17]。

3 外泌体在血管生成中的作用机制

血管生成是肿瘤增殖和侵袭转移的重要环节。多种蛋白与血管生成密切相关，例如经典的VEGFs、表皮生长因子受体家族(EGFRs)及内皮细胞分泌的血管抑制蛋白1(Vasohibin-1)[18,19]。近来与血管新生相关的外泌体及蛋白不断涌现，如前列腺源外泌体中活性氧簇、慢性粒细胞白血病细胞株K562源外泌体与磷酸化Scr蛋白等，这对揭示肿瘤血管生成机制并寻找抗癌新靶点意义深远[20,21]。

3.1 外泌体促进血管生成 现已证实膜联蛋白(Annexin Ⅱ)在肿瘤细胞分泌的外泌体中高度表达。研究[22]表明，相对于正常细胞，乳腺癌细胞中Annexin Ⅱ高表达，且乳腺癌源外泌体中Annexin Ⅱ能够促进tPA依赖的血管生成，这一作用得到体内体外实验结果支持。HEF野生型人神经母细胞瘤细胞源外泌体能够增加有利于血管新生及肿瘤耐药的蛋白分泌[23]。抗凋亡基因蛋白HAX-1在多种肿瘤细胞中表达，其有助于肿瘤细胞侵袭。一项研究[24]发现HAX-1在鼻咽癌细胞中高表达且与鼻咽癌患者的淋巴结转移及预后密切相关；进一步研究表明鼻咽癌细胞源外泌体中HAX-1呈高水平，且HAX-1能够增强人脐静脉内皮细胞的血管新生能力，这表明鼻咽癌细胞源外泌体中的HAX-1促进血管新生可能是其有利于鼻咽癌生长转移的因素。有学者[25]发现人胶质母细胞瘤株U251源外泌体促进人脑微血管内皮细胞血管生成的能力与其载有多种促血管生成蛋白密切相关，这些促血管生成蛋白主要包括明胶酶、纤溶酶原激活剂、VEGF、TGF-β及CXCR4趋化因子受体。另一项研究同样支持肿瘤细胞源外泌体可促进血管生成。Hsu等[26]的研究揭示了缺氧条件下的肺癌细胞不仅产生更多外泌体，而且外泌体中miRNA-23a表达亦升高；缺氧肺癌细胞源外泌体中的miRNA-23a能够作用于受体表皮细胞内的脯氨酰羟化酶1、2，导致细胞内缺氧诱导因子1(HIF-1)水平升高，有利于血管新生；此外，miRNA-23a尚能直接抑制紧密连接蛋白ZO-1表达，导致血管通透性增高、肺癌细胞跨血管迁移。

3.2 外泌体抑制血管生成 与上述作用相反，Pakravan等[27]发现间质干细胞源的外泌体能够通过靶向mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路而抑制乳腺癌细胞血管生成，并且该抑制作用与外泌体剂量成正比；发挥抑制作用的关键是间质干细胞源外泌体内的miRNA-100转入乳腺癌细胞，如果miRNA-100被敲除，VEGF生成抑制的作用将被解除。Yang等[28]研究亦证明外泌体可抑制肿瘤血管新生，且靶点为VEFGR2。研究人员从受疟原虫感染小鼠血浆中分离纯化外泌体，将这些外泌体注入肺癌细胞株Lewis荷瘤小鼠体内，与对照组相比，疟原虫感染源外泌体能显著抑制瘤体生长；体外实验中发现，疟原虫感染源外泌体与表皮细胞培养后能抑制细胞中VEGFR2的表达和表皮细胞迁移。该学者还发现疟原虫感染源外泌体内含有的miRNA-16/322/497/17是抑制血管生成的决定性因素。

随着外泌体分离及鉴定等相关技术的发展，外泌体相关研究会在多种肿瘤防治层面得到体现，如外泌体对肿瘤细胞信号通路调控和关键蛋白表达的影响，特异性外泌体在肿瘤诊断、预后及治疗评估中的应用，外泌体作为纳米级抗肿瘤药物载体的应用，以及外泌体作为疫苗用于免疫治疗等。此外，在调节外泌体水平抗肿瘤的相关中医药研究中亦有许多抗肿瘤中药单体涌现。中药复方与外泌体相结合有利于发挥抗肿瘤多靶点优势，其纵向具体机制将会在后续研究中得到进一步揭示。值得关注的是外泌体具有双重或多元效应，不同来源或载有不同核酸和蛋白的外泌体对同一类型肿瘤细胞有着双重影响，甚至相同来源的外泌体对肿瘤细胞增殖和侵袭作用并不一致。外泌体在人体体液中广泛存在，参与或介导肿瘤细胞生长、侵袭和迁移、耐药、免疫逃逸、细胞凋亡等多个环节，深入研究外泌体并揭示其作用机制有利于推动外泌体在肿瘤早期诊断和临床治疗中的应用。

参考文献：

[1] Qin Y, Peng Y, Zhao W, et al. Myostatin inhibits osteoblastic differentiation by suppressing osteocyte-derived exosomal microRNA-218: A novel mechanism in muscle-bone communication[J]. Biol Chem, 2017,292(26):11021-11033.

[2] Agarwal U, George A, Bhutani S, et al. Experimental, systems, and computational approaches to understanding the microRNA-mediated reparative potential of cardiac progenitor cell-derived exosomes from pediatric patients[J]. Circ Res, 2017,120(4):701-712.

[3] Chen JJ, Zhao B, Zhao J, et al. Potential roles of exosomal microRNAs as diagnostic biomarkers and therapeutic application in alzheimer′s disease[J]. Neural Plast, 2017:7027380.

[4] Mirzaei H, Sahebkar A, Jaafari MR, et al. Diagnostic and therapeutic potential of exosomes in cancer: the beginning of a new tale[J]. Cell Physiol, 2017,232(12):3251-3260.

[5] Patel GK, Khan MA, Bhardwaj A, et al. Exosomes confer chemoresistance to pancreatic cancer cells by promoting ROS detoxification and miR-155-mediated suppression of key gemcitabine-metabolising enzyme, DCK[J]. Br J Cancer, 2017,116(5):609-619.

[6] Wang J, De Veirman K, De Beule N, et al. The bone marrow microenvironment enhances multiple myeloma progression by exosome-mediated activation of myeloid-derived suppressor cells[J]. Oncotarget, 2015,6(41):43992-44004.

[7] Li Y, Yang Y, Xiong A, et al. Comparative gene expression analysis of lymphocytes treated with exosomes derived from ovarian cancer and ovarian cysts[J]. Front Immunol, 2017,8:607.

[8] Labani-Motlagh A, Israelsson P, Ottander U, et al. Differential expression of ligands for NKG2D and DNAM-1 receptors by epithelial ovarian cancer-derived exosomes and its influence on NK cell cytotoxicity[J]. Tumour Biol, 2016,37(4):5455-5466.

[9] Tang XJ, Sun XY, Huang KM, et al. Therapeutic potential of CAR-T cell-derived exosomes: a cell-free modality for targeted cancer therapy[J]. Oncotarget, 2015,6(42):44179-44190.

[10] Koyama Y, Ito T, Hasegawa A, et al. Exosomes derived from tumor cells genetically modified to express Mycobacterium tuberculosis antigen: a novel vaccine for cancer therapy[J]. Biotechnol Lett, 2016,38(11):1857-1866.

[11] Hiltbrunner S, Larssen P, Eldh M, et al. Exosomal cancer immunotherapy is independent of MHC molecules on exosomes[J]. Oncotarget, 2016,7(25):38707-38717.

[12] Ouyang S, Song X, Wang Y, et al. Structural analysis of the STING adaptor protein reveals a hydrophobic dimer interface and mode of cyclic di-GMP binding[J]. Immunity, 2012,36(6):1073-1086.

[13] Kitai Y, Kawasaki T, Sueyoshi T, et al. DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity[J]. J Immunol, 2017,198(4):1649-1659.

[14] Chen J, Cao SW, Cai Z, et al. Epithelial-mesenchymal transition phenotypes of circulating tumor cells correlate with the clinical stages and cancer metastasis in hepatocellular carcinoma patients[J]. Cancer Biomark, 2017,20(4):487-498.

[15] Rahman MA, Barger JF, Lovat F, et al. Lung cancer exosomes as drivers of epithelial mesenchymal transition[J]. Oncotarget, 2016,7(34):54852-54866.

[16] Donnarumma E, Fiore D, Nappa M, et al. Cancer-associated fibroblasts release exosomal microRNAs that dictate an aggressive phenotype in breast cancer[J]. Oncotarget, 2017,8(12):19592-19608.

[17] Min H, Sun X, Yang X, et al. Exosomes derived from irradiated esophageal carcinoma-infiltrating T cells promote metastasis by inducing the epithelial-mesenchymal transition in esophageal cancer cells[J]. Pathol Oncol Res, 2017,24(1):11-18.

[18] Du H, Zhao J, Hai L, et al. The roles of vasohibin and its family members: beyond angiogenesis modulators[J]. Cancer Biol Ther, 2017,18(11):827-832.

[19] Wang J, Chen J, Guo Y, et al. Strategies targeting angiogenesis in advanced non-small cell lung cancer[J]. Oncotarget, 2017,8(32):53854-53872.

[20] Alcayaga-Miranda F, Gonzalez PL, Lopez-Verrilli A, et al. Prostate tumor-induced angiogenesis is blocked by exosomes derived from menstrual stem cells through the inhibition of reactive oxygen species[J]. Oncotarget, 2016,7(28):44462-44477.

[21] Huaitong X, Yuanyong F, Yueqin T, et al. Microvesicles releasing by oral cancer cells enhance endothelial cell angiogenesis via Shh/RhoA signaling pathway[J]. Cancer Biol Ther, 2017,18(10):783-791.

[22] Maji S, Chaudhary P, Akopova I, et al. Exosomal annexin II promotes angiogenesis and breast cancer metastasis[J]. Mol Cancer Res, 2017,15(1):93-105.

[23] Mrowczynski OD, Madhankumar AB, Slagle-Webb B, et al. HFE genotype affects exosome phenotype in cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2017,1861(8):1921-1928.

[24] You B, Cao X, Shao X, et al. Clinical and biological significance of HAX-1 overexpression in nasopharyngeal carcinoma[J]. Oncotarget, 2016,7(11):12505-24.

[25] Giusti I, Delle MS, Di FM, et al. From glioblastoma to endothelial cells through extracellular vesicles: messages for angiogenesis[J]. Tumour Biol, 2016,37(9):12743-12753.

[26] Hsu YL, Hung JY, Chang WA, et al. Hypoxic lung cancer-secreted exosomal miR-23a increased angiogenesis and vascular permeability by targeting prolyl hydroxylase and tight junction protein ZO-1[J]. Oncogene, 2017,36(34):4929-4942.

[27] Pakravan K, Babashah S, Sadeghizadeh M, et al. MicroRNA-100 shuttled by mesenchymal stem cell-derived exosomes suppresses in vitro angiogenesis through modulating the mTOR/HIF-1α/VEGF signaling axis in breast cancer cells[J]. Cell Oncol, 2017,40(5):1-14.

[28] Yang Y, Liu Q, Lu J, et al. Exosomes from Plasmodium-infected hosts inhibit tumor angiogenesis in a murine Lewis lung cancer model[J]. Oncogenesis, 2017,6(6):e351.