卵子透明带激光浅层、深层打孔卵胞质内单精子显微注射体外受精效果对比观察

于成和，张丽蓉，柴蓓蓓，张若鹏,李娟

(大理大学第一附属医院，云南大理 671000)

卵子存活率，改善不孕症治疗结局[2]。然而国内外并未报道透明带削薄程度对ICSI结局的影响。本研究比较了透明带不打孔、浅层打孔、深层打孔ICSI操作的注射深度、胞质漏出率、卵子存活率、受精率、2PN率、优质胚胎率，探讨透明带激光打孔辅助ICSI操作时最适宜的打孔深度。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年5月～2017年3月于大理大学第一附属医院生殖医学科接受长效长方案+ICSI治疗的男性不育症夫妇为研究对象。夫妻双方均同意选择“激光辅助ICSI术”治疗并签署知情同意书。妻子年龄为(28.7±3.7)岁，丈夫年龄(29.1±3.8)，不育年限(4.3±3.1)年，Gn天数(10.6±1.7)d，Gn用量(1 973.52±635.32)IU，获得成熟卵子数(11.6±4.8)枚，卵子直径(159.16±11.22)μm，透明带厚度为(16.32±3.02)μm。若获得成熟卵子数≤2枚，则均行常规ICSI；若获得3枚成熟卵子，第1、2枚卵子行常规ICSI，第3枚行透明带浅层激光打孔+ICSI；若获得4枚成熟卵子，第1、2枚卵子行常规ICSI，第3枚行透明带浅层激光打孔+ICSI，第4枚行透明带深层激光打孔+ICSI；若获得5枚成熟卵子，第1、2、5枚卵子行常规ICSI，第3枚行透明带浅层激光打孔+ICSI，第4枚行透明带深层激光打孔+ICSI；若获得6枚成熟卵子，第1、2、5、6枚卵子行常规ICSI，第3枚行透明带浅层激光打孔+ICSI，第4枚行透明带深层激光打孔+ICSI；若获得7枚成熟卵子，第1、2、5、6枚卵子行常规ICSI，第3、7枚行透明带浅层激光打孔+ICSI，第4枚行透明带深层激光打孔+ICSI；若获得8枚成熟卵子，第1、2、5、6枚卵子行常规ICSI，第3、7枚行透明带浅层激光打孔+ICSI，第4、8枚行透明带深层激光打孔+ICSI；以此类推。共有483枚成熟卵子接受常规ICSI，为C-ICSI组；237枚成熟卵子接受透明带浅层激光打孔+ICSI，为LA1-ICSI组；182枚成熟卵子接受透明带深层激光打孔+ICSI，为LA2-ICSI组。

1.2 控制性超促排卵、透明带激光打孔及ICSI操作方法 根据文献[3]方法对患者实施长方案促排卵，当超声检查可利用卵泡(≥16 mm)数达卵泡总数60%以上时，给予250 mg重组人绒毛膜促性腺素(hCG)诱导卵泡成熟。注射hCG后36～38 h，经阴道超声指引下取卵。根据实验室ICSI操作常规[4]完成安装并调整注射针(ICSI针)及持卵针(Holding针)、配注射盘、卵子随机装入注射滴内等准备工作，并将精子制动后吸入注射针内待注射。Holding针在3点钟位置固定卵子，拨动卵子，使极体处于6或12点钟。C-ICSI组按照常规方法[4]行ICSI，LA1-ICSI组、LA2-ICSI组在9点钟位置使用激光破膜仪(RI公司，英国)分别在透明带浅层(削薄厚度<1/2透明带)、深层(削薄厚度≥1/2透明带)低能量单次打孔(激光脉冲宽度<0.4 ms，孔径尺度约3 μm)，每次激光打孔的孔径和强度一致。打孔结束后，注射针穿过孔径完成注射过程。

1.3 体外受精效果相关指标检测方法 ①ICSI过程中观察穿刺深度和胞质漏出情况。穿刺深度是指进针结束抽吸卵胞质时，针尖至透明带外侧缘穿刺点的距离。胞质漏出是指回吹胞质时观察到胞质从针嘴漏出，或注射结束卵间隙内可见漏出胞质，计算胞质漏出率。胞质漏出率=胞质漏出卵子个数/成熟卵子总数×100%。②ICSI后16～18 h观察卵子存活及受精情况，胞质内观察到2个原核(PN)视为正常受精。计算卵子存活率、受精率、2PN率。卵子存活率=存活卵子数/成熟卵子总数×100%，受精率=(2PN+1PN+多PN)卵子数/成熟卵子总数×100%，2PN率=2PN数/成熟卵子总数×100%。③ICSI后43～45 h采用四级评分法评估胚胎质量[5]，Ⅰ、Ⅱ级胚胎评定为优质胚胎。优质胚胎率=(Ⅰ级胚胎数+Ⅱ级胚胎数)/2PN胚胎数×100%。

2 结果

2.1 三组注射深度和胞质漏出情况比较 C-ICSI 组、LA1-ICSI组、LA2-ICSI组注射深度分别为(64.72±8.97)、(50.63±5.77)、(45.44±6.75)μm。LA1-ICSI组、LA2-ICSI组注射深度少于C-ICSI组(P均<0.05)；LA1-ICSI组注射深度与LA2-ICSI组相比，P>0.05。C-ICSI组、LA1-ICSI组、LA2-ICSI组胞质漏出率分别为25.05%(121/483)、28.69%(68/237)、35.71%(65/182)。LA2-ICSI组胞质漏出率高于C-ICSI组，P<0.05；LA1-ICSI组胞质漏出率与LA2-ICSI组和C-ICSI组相比，P均>0.05。

2.2 三组卵子存活及受精情况比较 C-ICSI 组、LA1-ICSI组、LA2-ICSI组卵子存活率分别为85.71%(414/483)、95.78%(227/237)、98.90%(180/182)。LA1-ICSI组、LA2-ICSI组卵子存活率高于C-ICSI组(P均<0.05);LA1-ICSI组卵子存活率与LA2-ICSI组相比，P>0.05。C-ICSI 组、LA1-ICSI组、LA2-ICSI组受精率分别为78.26%(378/483)、81.86%(194/237)、75.27%(137/182)，三组受精率相比，P均>0.05。C-ICSI组、LA1-ICSI组、LA2-ICSI组2PN率分别为70.60%(341/483)、72.15%(171/237)、68.68%(125/182)，三组2PN率相比，P均>0.05。

2.3 三组优质胚胎率比较 C-ICSI组、LA1-ICSI组、LA2-ICSI组优质胚胎率分别为47.80%(163/341)、58.48%(100/171)、39.20%(49/125)。LA1-ICSI组优质胚胎率显著高于C-ICSI组和LA2-ICSI组(P均<0.05)；LA2-ICSI组优质胚胎率与C-ICSI组相比，P>0.05。

3 讨论

在临床工作中，ICSI治疗结局可受多方面因素影响，例如实验室技术人员操作方法、卵子质量、精子质量等[6]。与IVF相比，ICSI具有更高受精率，但并没有得到更高囊胚形成率及着床率，其原因可能与注射过程损伤卵子和精子有关。因此，探讨适宜的方法进一步减少注射对卵子的影响是ICSI相关临床研究的热点[7]。有学者用激光在透明带上打孔，再通过该孔完成ICSI，发现该方法能有效提高卵子成活率[8]。本研究结果显示，LA1-ICSI组和LA2-ICSI组注射深度均显著低于C-ICSI组，而LA1-ICSI组注射深度比LA2-ICSI组深；LA1-ICSI组和LA2-ICSI组卵子存活率均显著高于C-ICSI组，而LA2-ICSI组卵子存活率略高于LA1-ICSI组。表明透明带浅层、深层激光打孔后行ICSI可以通过降低注射阻力而降低注射深度，从而减少注射对卵子所产生的机械损害，因此显著提高了卵子存活率。对于获卵数较少的患者，这种新方法能额外挽救卵子，具有较高临床价值。

文献报道，透明带激光打孔辅助ICSI可提高优质胚胎率[3]，并提高胚胎着床率[9]。本研究结果显示，LA1-ICSI组优质胚胎率显著高于C-ICSI组，与文献[9]报道类似。本研究结果还显示，LA1-ICSI组优质胚胎率高于LA2-ICSI组，LA2-ICSI组优质胚胎率仅与C-ICSI组相当，表明采用透明带深层激光打孔不但不能进一步提高胚胎质量，还会降低胚胎质量。究其原因，一是透明带除了支持保护卵子外，还为卵母细胞提供必要的物质通道。有研究表明，在透明带表面镶嵌着许多蛋白，任何一种蛋白的缺失都会影响透明带功能和卵子、胚胎的发育[10]。因此，透明带上激光打孔越深，对透明带结构破坏越大，越影响其生理功能，反而影响胚胎发育。其二，透明带深层激光打孔能破坏卵间隙相对密闭的环境，减少卵间隙抽吸负压，降低注射过程中细胞膜回收能力，导致胞质易漏出。其三，透明带上激光打孔较深导致注射深度较浅，细胞膜不能完全封闭ICSI针口，导致胞质漏出，从而降低胚胎发育能力。本研究结果显示，LA2-ICSI组胞质漏出率高于C-ICSI组、LA1-ICSI组，可以解释本研究结果。

文献报道，透明带激光打孔可提高ICSI受精率，对临床妊娠率无明显影响[9]。而有研究[3]表明透明带激光打孔并不能显著提高ICSI后受精率。本研究结果显示，LA1-ICSI组受精率最高，C-ICSI组次之，LA2-ICSI组最低，虽然组间差异均无统计学意义，但也说明透明带激光打孔对ICSI卵子受精是有利的[11～14]。

综上所述，与不打孔相比，透明带浅层、深层激光打孔后行ICSI注射深度较低，卵子存活率和优质胚胎率较高。与透明带浅层激光打孔相比，透明带深层激光打孔后行ICSI可以进一步降低注射深度，但优质胚胎率降低。ICSI前应该行透明带浅层激光打孔。

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