miR-let7c对小鼠精原细胞株GC-1spg细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A表达的调控作用

王欢，江莉，唐媛媛，周洁

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

男性不育症病因复杂，目前认为主要的病因有染色体结构或基因调控异常、全身性或神经性疾病、感染、外伤、医源性损伤、内分泌失调、环境因素、免疫因素等。精子发生是一个复杂的多因素调控过程，miRNA通过调控其靶基因转录和翻译而影响精子发生过程。研究表明，miRNA let7家族在精子运动、获能、受精和胚胎发育中有重要作用，但具体机制不清楚[1]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A(CDKN1A)是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKI)家族成员之一，是细胞周期重要的调控因子。本研究通过转染miR-let7c沉默及过表达慢病毒质粒载体，初步研究miR-let7c对精原细胞系GC-1spg中CDKN1A表达的影响，探讨miR-let7c对精子发生影响的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠精原细胞株GC-1spg购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库；miR-let7c过表达、沉默表达慢病毒和空载对照慢病毒包装等由上海吉凯基因科技有限公司完成；AxyPrep总RNA小量制备试剂盒购自Axygen公司；引物内参GAPDH、Reverse Transcriptase、SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，引物设计、合成也由日本TaKaRa公司完成；10%胎牛血清、Trypsin-EDTA Solution和DMEM培养基购自Gibco公司；内参β-actin(HRP标记)购自PTG公司；羊抗兔二抗购自ABCAM公司。

1.2 miR-let7c慢病毒载体的构建 设计合成带有末端保护碱基、AgeI、EcoRI的酶切位点的mmu-miR-let7c引物。mmu-miR-let7c上游引物序列为5′-GGAAAGGACGAAACACCGGTATTCTATCTACAACC-TTGCCAAGC-3′，下游引物序列为5′-TGTCTCGAGGTCGAGAATTAAAAAAGGTAATGCATTAAGGCCTC-3′；mmu-let-7c-5p-inhibition上游引物序列为5′-AATTCAAAAATGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT-3′，下游引物序列为5′-CCGGAACCATACAACCTACTACCTCATTTTTG-3′。扩增pre-miR-let7c序列。经酶切后连接入慢病毒表达载体GV309(miRNA慢病毒载体)或GV280(miRNA-inhibition慢病毒载体)，慢病毒载体元件顺序：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。经转化、PCR法筛选挑取阳性克隆，经测序鉴定为pre-miR-let7c序列后抽提质粒。GV309-miR-let7c(对照组为GV309空质粒)、Helper1.0、Helper 2.0三质粒共转染293T细胞，以10%FBS的DMEM培养48～72 h后收集上清即为病毒。

1.3 细胞分组及miR-let7c过表达、沉默表达慢病毒质粒转染 GC-1spg细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，放置在37 ℃、5%CO2的培养箱。将处于对数生长期的GC-1spg细胞消化成细胞悬液分入6孔板中培养，当融合度为10%～20%时进行转染。设miR-let7c上调组、miR-let7c下调组和对照组，分别转染miR-let7c过表达慢病毒、miR-let7c沉默表达慢病毒、空载病毒，感染复数(MOI)=75，感染72 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达并计算转染效率，转染效率>90%者继续培养用于后续实验。

1.4 各组精原细胞CDKN1A mRNA检测 提取各组精原细胞总RNA，测定RNA浓度及纯度。按照TaKaRa公司逆转录试剂盒说明书反转录成单链cDNA。以GAPDH为内参照行实时荧光定量PCR反应。CDKN1A上游引物序列为5′-GTCGCTGTCTTGCACTCTGG-3′，下游引物序列为5′-CCAATCTGCGCTTGGAGTGATA-3′；GAPDH上游引物序列为5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物序列为5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。实时定量PCR反应体系均为20 μL，其中包括Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物终浓度0.8 μmol/L，其余体积用灭菌水补足。在Lightcycler 96 PCR仪中使用两步法扩增：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火与延伸60 ℃ 20 s，共40个循环。每次循环结束时收集荧光。以2-ΔΔCt表示三组CDKN1A mRNA相对表达量，实验重复3次，取平均值。

1.5 三组CDKN1A蛋白检测 采用Western blotting法。先用RIPA裂解液提取各组细胞的总蛋白，BCA蛋白定量法测定蛋白光密度(OD)值，根据蛋白含量绘制标准曲线，配置5%浓缩胶和12%分离胶，在电泳槽内加入电泳缓冲液，80 V恒压电泳至溴酚蓝跑出浓缩胶层，时间约为30 min，分离胶电泳为120 V。当溴酚蓝迁移至距离分离胶下缘约1 cm时终止电泳，转膜。400 mA稳流电转移1 h，将PVDF膜浸入5% BSA的封闭液中，室温封闭1 h。使用ECL化学发光显影。以CDKN1A条带和内参照β-actin条带灰度值之比表示CDKN1A蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 三组CDKN1A mRNA表达比较 miR-let7c上调组、miR-let7c下调组、对照组CDKN1A mRNA相对表达量分别为0.005 6±0.000 9、0.039 1±0.006 7、0.021 9±0.001 8。与对照组比较，miR-let7c上调组CDKN1A mRNA相对表达量低于miR-let7c下调组及对照组(P均<0.01)，miR-let7c下调组CDKN1A mRNA相对表达量高于对照组(P<0.01)。

2.2 三组CDKN1A蛋白表达比较 miR-let7c上调组、miR-let7c下调组、对照组CDKN1A蛋白相对表达量分别为0.034 8±0.002 6、0.833 5±0.053 2、0.257 4±0.070 9。与对照组比较，miR-let7c上调组CDKN1A蛋白相对表达量低于miR-let7c下调组及对照组(P均<0.01)，miR-let7c下调组CDKN1A蛋白相对表达量高于对照组(P<0.01)。

3 讨论

miRNA是内源性的非编码小分子RNA，长度为22～24个核苷酸。miRNA通过与靶mRNA 3′-UTR区形成互补序列，使靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而调控基因的转录后水平[2]。miRNA主要是对内源性mRNA进行修饰，并且在表达上具有发育时序性和组织特异性，参与细胞的生长、增殖和凋亡等过程。miRNA在哺乳动物的睾丸、附睾、精子和精浆中广泛表达，并在原始生殖细胞(PGCs)、精原干细胞(SSCs)和精原细胞中有更高的表达水平，参与精子发生发育和成熟的各个阶段[3]，因而被认为是生殖细胞发育的强有力调节器。目前已发现miR-17-92簇和miR-let-7家族(a、d、e、c、g)能调控PGCs增殖和发育。miR-17-92基因簇是含有共同miRNAs位点的4个不同miRNA家族(miR-17、miR-18、miR-19、miR-25)，可能参与SSCs的早期分化，也在未分化的精原细胞中表达，在分化过程中表达下调。miR-17-92基因簇能下调E2F1基因，避免精子发生过程中减数分裂的细胞凋亡。敲除miR-17-92基因簇的成年小鼠，其生殖功能障碍，出现异常的睾丸表型，包括睾丸严重萎缩、精原细胞和SSCs丢失、生殖细胞凋亡和精子生成减少等[4]。let7被广泛用于肿瘤和干细胞包括多种细胞抗凋亡和增殖途径的相关研究[5]。有研究发现，let-7能直接调节细胞周期关键的原癌基因，如RAS、CDC25A、CDK6、Cyclin D等，阻断细胞G1/S期的转换过程，从而抑制肿瘤细胞增殖[6]。精子发生是精原干细胞不断自我更新、动态的、复杂的过程，SSCs的自我更新和细胞池之间的平衡受到严格而周密的调控，当SSCs出现过度的自我更新或分化时，打破了平衡的调控网，从而导致男性不育[7]。Toledano等[8]研究发现let-7过表达可导致果蝇生殖干细胞减少。Shinoda等[9]认为过表达的let-7通过靶向Lin28a减少雄性生殖细胞的数量。此外，精浆中miR-19b和let-7a的异常表达可导致生精障碍[10]。在睾丸组织中，miR-let-7a-1、miR-let-7a-2、miR-1et-7a-3、miR-let-7b、miR-1et-7c、miR-let-7d、miR-let-7d-v1、miR-let-7d-v2、miR-let-7e、miR-let-7f-1、miR-let-7g等特异表达，在维持干细胞增殖、分化和自我更新能力的过程中也起到重要调控作用。因此我们选择miR-let7c为研究目标，探讨其在精子发生中的作用机制。

本研究结果显示miR-let7c上调组GC-1spg细胞中CDKN1A mRNA和蛋白表达量显著降低，miR-let7c下调组GC-1spg细胞中CDKN1A mRNA和蛋白表达量显著升高，说明miR-let7c能够负向调控CDKN1A的表达。miRNA的调控作用贯穿到精子发生发育和成熟的整个过程。这些过程需要一个精准的、具有空间性和时间性的基因调控表达模式。目前已经发现了一些与精子活力有关的基因，如Tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11、AKAP3、AKAP4、SEPT4、SMCP、SEMG1、CRISP2等。CDKN1A是细胞周期重要的负性调控因子，可与G1-S/CDK(G1-S/细胞周期蛋白依赖激酶，CDK2)和S/CDK复合物结合，调节细胞周期G1期向S期过渡过程[11]，在转录、翻译后修饰、DNA复制和修复等途径中发挥重要作用。此外CDKN1A还扮演调节细胞存活和细胞凋亡的双重角色，这主要取决于CDKN1A在细胞内的定位[12]。CDKN1A对调节精原干细胞种系传递起关键作用，被认为是维持睾丸生殖细胞完整性的守护者[13]。在正常睾丸组织，CDKN1A在粗线期精母细胞和精子细胞中的表达最高[5]。精母细胞、精子细胞和精子等雄性生殖细胞对DNA损伤因素易感，而DNA损伤途径受到CDKN1A的调控，后者还参与DNA损伤后的细胞周期进程[14,15]。当CDKN1A的表达受到抑制，在细胞没有进行DNA修复的时候就进入细胞周期，复制了错误的遗传信号，阻滞了细胞周期进程。结合本研究结果，笔者推测，在SSCs的自我更新或分化中，为了避免出现过度活跃的细胞增殖，miR-let7c通过负向调控CDKN1A而抑制细胞增殖，阻滞了细胞周期G1期向S期过渡，维持SSCs细胞池之间的平衡，确保精子发生调控过程的精准性。

目前对miRNA参与生殖细胞增殖、分化和凋亡的调控作用的研究主要集中在精子发生的中晚期阶段，而对精子发生早期阶段的研究较少，尤其是从精母细胞到精原细胞的过程。本研究结果为后续探讨miR-let7c在男性不育临床诊断及治疗中的应用提供了理论依据。而miR-let7c如何通过CDKN1A调控精子发生的作用机制将有待进一步研究。

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