耗牛沙门氏菌病诊断

陈天祥，吴毅鹏，扎巴多吉，张斌

（1.四川省若尔盖县农业畜牧和水务局，四川 若尔盖 624500；2.四川省若尔盖县达扎寺镇畜牧兽医站，四川 若尔盖 624500；3.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

牦牛沙门氏菌病也称犊牛副伤寒，引发本病的是沙门氏菌。本病主要感染10～30日龄的犊牛，对犊牛危害较严重，呈流行性发生。

1 临床症状和病理变化

病牛腹泻，体温升高达40℃，精神沉郁、呼吸困难，排含黏液的稀便，后期拒食、卧地不起，部分牦牛发病7d左右死亡。

剖检可见患牛有出血性胃肠炎，真胃空虚，黏膜充血，肠内容物稀薄，肝、脾脏肿大，肠壁上有不易脱落的麦粒状黄色颗粒，肺表面有坏死灶。

2 实验室诊断

2.1 镜检 采取病死牦牛肝、肺革兰氏染色，镜检，见两端椭圆、不运动，不形成芽孢和荚膜的革兰氏阴性短杆菌。

2.2 细菌分离培养 无菌采集病死牦牛的肝、肺、脾接种于普通琼脂培养基和鲜血培养基，37℃培养24h，结果普通琼脂培养基、鲜血平板培养基上均长出圆形，表面光滑、湿润，周围无溶血，边缘整齐的小菌落。

2.3 核酸提取 分别采用酚-氯仿法和Trizol法提取5份腹泻病料的DNA和RNA，并将RNA反转录成cDNA。DNA用于沙门氏菌的检测，cDNA用于牦牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、冠状病毒的检测。提取完成的DNA和cDNA放于-20℃条件下备用。

2.4 PCR检测 根据文献引用一对沙门氏菌特异性引物进行PCR扩增，以鉴定该菌是否为沙门氏菌，扩增片段大小为498bp。另外用三对引物检测牦牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒和冠状病毒。PCR反应体系为：Quick Taq HS DyeMix 5 μL，上、下游引物（均为 10 pmol/L）各 0.5 μL，DNA模板1μL，ddH2O 3μL。PCR反应条件为：94℃预变性2min、94℃变性30s、57℃复性30s、68℃延伸1min，扩增35个循环，最后72℃延伸10min，4℃终止反应。

取5 μL扩增产物经琼脂糖凝胶核酸电泳和凝胶成像扫描仪检测与分析，凝胶成像系统显示有3个样本呈阳性，与阳性模板目的条带大小一致（284 bp）。从5份腹泻样本中的cDNA中未检测出牦牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒和冠状病毒。

2.5 药敏试验 用常规纸片法进行药敏试验，所用药片为：丁胺卡那霉素、头孢氨噻肟、氟哌酸、奥复星、新霉素、卡那霉素、菌必治、氟苯尼考、丙氟哌酸、庆大霉素、氨苄青霉素、罗红霉素、恩诺沙星、新生霉素、头孢西丁。结果沙门氏菌对丁胺卡那霉素、头孢氨噻肟、氟哌酸、奥复星、新霉素、卡那霉素、菌必治、氟苯尼考、恩诺沙星高度敏感，对丙氟哌酸、庆大霉素、氨苄青霉素中度敏感，对新生霉素、罗红霉素、头孢西丁低度敏感。