重组人胰高糖素样多肽-1(rhGLP-1)对人肝细胞系HL-7702胰岛素信号通路的影响

张学年，姚 瑶，王宏宇，王 意，徐 春

胰高糖素样多肽-1(GLP-1)是由小肠L细胞分泌的一种激素，是由37个氨基酸组成的肽链，其中第7到第36个氨基酸的片段GLP-1(7-36)具有生物活性，GLP-1(7-36)作用于β细胞膜的GLP-1受体，促进胰岛素分泌[1]。体内的GLP-1很快被二肽基肽酶-4(DPP-4)分解,GLP-1受体激动剂的结构与人GLP-1有差异，不会被DPP-4酶降解。rhGLP-1(7-36)是基因合成的人GLP-1(7-36)，与人GLP-1生物活性片段完全一致，用rhGLP-1(7-36)研究GLP-1在肝细胞中的作用机制，较用GLP-1受体激动剂更能反映人体自身的情况。

Akt又称PKB，是胰岛素信号通路PI3K/Akt中的重要信号分子。Akt的激活与两个位点的磷酸化有关：Ser473和Thr308，Akt在Ser473或Thr308位点的磷酸化(p-Akt)导致PI3K/Akt信号通路的激活。在人肝细胞中，PI3K/Akt信号通路的激活可激活mTORC通路,导致血脂的合成[2]。本研究通过测定人肝细胞HL7702中的Akt和p-Akt的表达量，探究GLP-1对人肝细胞PI3K-AKT-mTORC信号通路的影响，揭示GLP-1降低血脂的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞 人肝细胞系 HL-7702细胞株，购自上海中科院细胞所，培养条件：10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI1640培养液于37 ℃，5%CO2的湿化培养箱中培养。

1.1.2 主要试剂 rhGLP-1(7-36)由上海仁会生物制药股份有限公司惠赠；兔来源p-Akt(Thr308)单克隆抗体、兔来源p-Akt(Ser473)单克隆抗体、兔来源Akt单克隆抗体、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记抗鼠/兔IgG均购自美国Cell Signaling Technology公司。鼠来源actin单克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理 人肝细胞系HL-7702细胞株培养至对数生长期，按5×105/ml的密度均匀接种于60 mm培养皿上，随机分为4组：GLP-1低浓度组、GLP-1中浓度组、GLP-1高浓度组和对照组。细胞在37℃、5%CO2的湿化培养箱中培养24 h后，药物组分别更换为含有rhGLP-1(7-36)10 nM、100 nM、1000 nM的RPMI1640培养基继续培养24 h，空白对照组用RPMI1640培养基，所有细胞于37℃、5%CO2湿化培养箱中继续培养24 h。

1.2.2 蛋白质免疫印迹法(westernblot) 各组细胞培养24 h后，弃掉培养液，用RIPA裂解液充分裂解，16 000 g离心20 min。收集上清液，BCA法测定蛋白浓度并分装。制备8%分离胶和5%浓缩胶(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，SDS-PAGE)，等量蛋白与4×上样缓冲液混合，沸水中加热5 min至蛋白变性。蛋白上样，电泳。在100 V电压下将蛋白转至硝化纤维膜上。将膜用含5%脱脂奶粉的封闭液孵育3 h，而后孵育一抗，4 ℃过夜。TBST洗膜3次，每次5 min，室温下孵育二抗1 h。再次用TBST洗膜3次，每次5 min。用化学发光凝胶成像系统检测，用Image软件进行灰度分析。所有实验均重复3次以上。

1.3 统计学处理 使用SPSS22.0软件对数据进行统计分析。各组数据间的显著性检验采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GLP-1对人肝HL7702细胞系Akt表达量的影响 与对照组相比，GLP-1低浓度组、GLP-1中浓度组、GLP-1高浓度组 Akt 蛋白的表达水平无明显差异(表1)。

2.2 GLP-1对人肝HL7702细胞系p-Akt表达水平的影响 与对照组相比，p-Akt(Thr308)的表达量在GLP-1低浓度组、GLP-1中浓度组、GLP-1高浓度组明显下降；p-Akt(Ser473)的表达量在对照组与GLP-1不同浓度组之间差异均无统计学意义(表1)。

分组Akt表达量p-Akt(Ser473)表达量p-Akt(Th308)表达量对照组1±01±01±0GLP-1低浓度组0.85±0.120.58±0.090.60±0.27①GLP-1中浓度组0.83±0.050.65±0.150.54±0.15②GLP-1高浓度组0.69±0.280.69±0.220.61±0.18①

注：与对照组比较，①P<0.05，②P<0.01

3 讨 论

GLP-1类降糖药的作用机制尚未完全揭示，目前研究认为，GLP-1与胰岛β细胞表面的GLP-1受体结合，激活PKA通路和PI3K-AKT通路，导致一系列生物学效应[3]。关于GLP-1在肝细胞的作用也有研究，Guptal等[4]发现在人肝细胞表面存在GLP-1受体，GLP-1受体激动剂艾塞那肽通过调节肝细胞胰岛素信号传导系统，减少肝细胞的脂肪变性。最近很多研究发现GLP-1类药物具有调节血脂的作用：GLP-1降低糖尿病大鼠血清胆固醇和三酰甘油水平[5]；GLP-1降低糖尿病大鼠脂肪合成关键酶FAS的mRNA表达[6]。本研究发现rhGLP-1(7-36)对人肝细胞p-Akt的表达具有抑制作用，提示GLP-1抑制PI3K-AKT-mTORC信号通路。

PI3K-AKT-mTORC信号通路在人肝细胞脂代谢中起重要作用[2]，当血糖浓度升高时，胰岛素分泌增加，激活PI3K-AKT-mTORC信号通路，促进肝细胞合成脂肪。2型糖尿病患者的高胰岛素血症在肝脏出现了选择性胰岛素抵抗，即促进血脂合成的PI3K-AKT-mTORC信号通路处于激活状态，而促进糖原合成的PI3K-AKT通路处于抵抗状态，导致糖

尿病患者高血糖高血脂并存的临床表现[7]，抑制肝细胞PI3K-AKT-mTORC信号通路将会减少血脂的合成。本研究发现rhGLP-1(7-36)明显抑制肝细胞p-Akt的水平，提示GLP-1对肝细胞 PI3K-AKT-mTORC信号通路可能具有抑制作用。GLP-1在肝细胞通过抑制PI3K-AKT-mTORC信号通路降低脂肪的合成，这可能是GLP-1类降糖药降低血脂的机制之一，进一步研究需要分析PI3K-AKT-mTORC的下游靶蛋白如SREBPc-1的表达，以明确GLP-1对这一通路的抑制作用。

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