杨晓龙,韩海玉,王富平
(1.西藏山南市畜牧兽医总站 856000;2.西藏昌都市畜牧总站 854000;3.西藏山南市畜牧兽医总站 856000)
大肠埃希菌对婴儿和幼畜(禽),常引起严重腹泻和败血症,要从根本上预防和治疗由大肠埃希菌引起的此类疾病,制备免疫保护力高的疫苗被当前医学界认为是最有效的途径之一。本实验以仔猪源致病性大肠埃希菌为材料,采用培养后大肠埃希菌制成菌液与氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂和黄芪多糖佐剂分别制备免疫原。免疫家兔测其抗体效价,以期筛选出优良佐剂,为地区仔猪大肠埃希菌病的防治提供理论依据。
菌种:大肠埃希菌O144(编号为2-1-2),分离自青海省互助县某猪场。
养基及试剂:营养肉汤,营养琼脂,黄芪多糖注射液,维生素E软胶囊,三氯化铝。
试验动物 :非免疫健康兔,体重为2~3kg。
实验仪器:磁力搅拌器、微型振荡器、高压锅、恒温箱、离心机、4℃冰箱等。
制备菌悬液:将大肠埃希菌O144(2-1-2)接种于普通营养琼脂,37℃培养24h后用灭菌生理盐水洗下,制备浓度达到20亿/m1的菌悬液,最后加入终浓度为0.4%的甲醛溶液,充分混合后置于37℃灭活48h。
无菌检验:将灭活的菌悬液接种于营养肉汤,37℃培养48h,经检验无菌生长者为合格。
制备疫苗:根据文献制备氢氧化铝佐剂苗[1];根据文献资料相关方法制备矿物油佐剂苗[2]。
检验疫苗安全性:将制备好的疫苗分别皮下注射3只家兔,1m1/kg·体重,观察7d,记录试验家兔精神、运动和食欲等生理活动是否正常。
免疫接种将15只兔分成5组后编号。1组注射氢氧化铝佐剂疫苗;2组先肌肉注射1m1/kg·体重黄芪多糖,再用灭活菌悬液免疫;3组先投喂150~300IU/kg·体重维生素E,再用灭活菌悬液免疫试验动物;4组注射矿物油佐剂苗;5组注射不含佐剂疫苗。每只兔均皮下注射1m1/kg·体重,多点注射,以便使疫苗较快的吸收。共免疫两次,第一次注射后经14d再注射一次,两次注射剂量相同。
血清效价测定
第二次免疫后14d,无菌采血分离血清检测效价。
无菌试验结果成立;试验动物接种疫苗后初期精神怠倦,后好转,其后7d内精神、运动和食欲等生理活动未见异常表现,表明注射的疫苗安全性良好。血清效价测定结果详见表1。
表1 血清效价测定结果表
研究显示同一种抗原与不同佐剂结合,均能产生一定的免疫结果,其中采用新型的免疫佐剂均获得较高的抗体效价,维生素E佐剂所产生的抗体效价达到1:1024,黄芪多糖佐剂达到1:512,而临床常用的氢氧化铝佐剂效价只达到1:64,不加佐剂疫苗的抗体效价只有1:32。说明了新型免疫佐剂苗的效果比传统免疫佐剂苗的效果好很多。此实验结果可为今后研制免疫强度高效,毒性小,生产程序简单,低成本,易于推广的新型佐剂提供相关依据。
研制和开发新的免疫佐剂时应严格控制质量标准;利用天然材料制备佐剂时应从具有免疫活性的材料中广泛筛选,进一步保证其作为佐剂的可行性;所制备的佐剂化学成分和生物性状应清晰、稳定,易于储存,不发生变性;无短期和长期的毒副作用;且价格低廉,所开发的佐剂与抗原联合使用可以产生较强的免疫反应,且进入体内的佐剂要易于从体内自行降解,以期达到最好的免疫效果。