pH和NaCl质量浓度对发酵鱼糜中腐败菌Aeromonas veronii bv.veronii群体感应的影响

赵丹丹，刘琳，王迪，吕飞，丁玉庭，陈文烜，周绪霞*

1(浙江省农业科学院 食品科学研究所，浙江 杭州，310021)2(浙江工业大学 海洋学院，浙江 杭州，310014)

微生物引起的食品腐败变质是在基因水平受到群体感应(Quorum sensing，QS)调控的一种依赖菌体浓度发生的现象[1-3]。细菌通过QS系统来调控自身一些生理机能的表达，如生物膜的形成、鞭毛运动等毒力因子的表达，从而提高细菌的致病性以及在食品中的致腐性[4]。目前革兰氏阴性菌的QS系统主要是由N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactone，AHL)类信号分子调控。

气单胞菌是食品中常见的腐败菌[5-6]，可通过产生胞外酶、生物膜、肠毒素和溶血素等引起食品腐败变质，降低食品安全性[7-8]。本实验室在前期研究过程中开发了一种可以将鱼糜高值化利用的真菌发酵技术[9]，并在发酵鱼糜中筛选到了1株具有较强致腐能力的腐败菌，Aeromonasveroniibv.veronii。在研究过程中发现，A.veroniibv.veronii具有AHLs介导的QS系统，且其QS系统表达在培养过程中受环境变化发生改变。由此推测食物基质中存在的化合物和储藏环境会影响细菌的QS系统的表达[10]，且会进一步影响细菌的致腐性与致病性，因此研究环境因素对腐败菌的QS及相关代谢行为的影响对水产品的品质控制具有重要意义。目前仅有外国学者研究了培养条件对Aeromonashydrophila的QS系统的影响[10-11]，关于A.veroniibv.veronii的QS相关研究还未有报道。

本项目主要以发酵鱼糜中的腐败菌A.veroniibv.veronii为研究对象，研究环境因素(pH、NaCl质量浓度)对细菌A.veroniibv.veronii产AHLs活性、生物膜的形成及泳动能力的影响。该研究将加深对气单胞菌的QS现象的理解，为通过调控QS降低细菌毒性进而防止食品腐败的新策略提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

菌种：A.veroniibv.veronii，分离于发酵鱼糜；根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaeiensA136(pCF218/PCF372)，壮观霉素抗性，用量为50 μg/mL。所有菌种添加20%甘油保存于本实验室-80 ℃冰箱中。

试剂：盐酸、氯化钠、碳酸钠、甲酸、乙酸乙酯、三氯甲烷等为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇等为色谱纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司；营养肉汤(NB)、NB固体培养基、琼脂粉等，青岛海博生物技术有限公司；壮观霉素、X-gal、邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(oNPG)、十二烷基硫酸钠(SDS)、β-巯基乙醇、Z-buffer、结晶紫，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3C型数显酸度计，上海精科仪器有限公司；YXQ-LS-SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅，SW-CT-4D洁净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHP-9162型电热恒温培养箱，上海恒科学仪器有限公司；CR21GⅡ高速离心机，日本Hitachi公司；FV300激光共聚焦显微镜，日本OLYMPUS；SPECTRAmax M5酶标仪，美国Molecular Devices公司； StepOne型荧光定量PCR仪，美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值对细菌菌落总数和AHLs活性的影响

首先配制不同pH值(6.0、7.0、8.0)的NB液体培养基(含5 g/L NaCl)。将待测菌过夜活化12 h，利用生理盐水制备菌悬液，接种于不同pH值的100 mL NB培养基中，终浓度为1×103CFU/mL。30 ℃摇床培养18 h至细菌达生长稳定期，测定培养液中细菌的菌落总数及产生的AHLs活性。培养基的pH值用1 mol/L HCl溶液进行调节。

1.3.2 NaCl质量浓度对细菌菌落总数和AHLs活性的影响

首先配制不同NaCl质量浓度的(5、10、20 g/L)的NB液体培养基，且各培养基pH固定为7.0。将待测菌活化12 h，利用生理盐水制备菌悬液，接种于不同含盐量的100 mL NB培养基中，终浓度为1×103CFU/mL。30 ℃摇床培养18 h至细菌达生长稳定期，测定培养液中细菌的菌落总数及产生的AHLs活性。

1.3.3 菌落总数的测定

按照GB/T 4789.2—2008的方法计数。

1.3.4 AHLs的活性测定

A.veroniibv.veroni在不同条件下的AHLs活性通过监测报告菌根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶活性来反映。待测菌的β-半乳糖酶活性参照PONNUSAMY等[12]的方法来测定。将报告菌A.tumefaciensA 136 活化12 h后，用NB液体培养基按一定比例稀释至1×103CFU/mL，加入200 μL待测菌的培养上清液，培养至OD600≈0.6左右，记录OD600。另取5 mL离心管，依次加入800 μL Z-buffer、200 μL培养12 h的菌液、100 μL 0.1%SDS、150 μL三氯甲烷，充分振荡，加入100 μL的4 mg/mLoNPG，充分振荡，置于28 ℃的水浴中，待溶液变黄之后，加入600 μL的1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，记录反应时间。将反应液离心(10 000 r/min，5min)，测OD420。根据变色时间，OD420和OD600计算β-半乳糖苷酶的活性。每个处理设3个重复，以NB培养基做阴性对照。酶活力单位定义为：在所在条件下，每分钟分解1 moloNPG所需要的量为1个酶活力单位。计算公式为：酶活力=(1000×OD420)/(OD600×T×0.2 mL)，其中T为添加菌液的体积反应时间，单位为min。

(1)

1.3.5 生物膜形成能力的测定

参照PACKIAVATHY等[14]的方法，利用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope，CLSM)技术观察待测菌的生物膜在不同培养条件下的结构变化。取1 mL不同pH值(6.0、8.0)和不同含盐量(5、20 g/L)的NB培养基,加入24孔板中，同时将待测菌的生理盐水菌悬液，按1∶1 000的比例稀释，加入直径为1 cm的圆形盖玻片30 ℃静置培养24 h。将盖玻片取出，用无菌水轻轻冲洗玻片上未粘附的细胞，用0.1%吖啶橙染色1 min。洗去多余的染色液，将盖玻片置于CLSM下观察，该显微镜装有激发波长为515～560 nm的激发滤光器及60×(60倍)的油镜，其荧光显微镜照片与光镜照片均由Fluoview v5.0软件获得。

1.3.6 泳动能力的测定

参照PACKIAVATHY等[14]的方法，并稍作改动。首先制备不同pH值(6.0、7.0、8.0)和不同含盐量(5、10、20 g/L)的NB固体培养基(含0.3%琼脂)，灭菌后冷却至50 ℃时倒平板，待凝。将待测菌活化12 h后，取1.5 μL细菌培养液分别点样在含不同NB平板上，以无菌生理盐水为对照，将平板置于30 ℃培养箱中培养24 h，观察菌体变化拍照并测量菌落直径。

1.3.7 数据统计分析

运用SPSS 21.0 软件和Origin 8.5 软件进行数据分析。测定结果以均值±标准差(n≥3)表示，采用最小显著差异法(LSD)进行显著性差异分析，显著性水平为5%。

2 结果与分析

2.1 pH对A. veronii bv. veronii QS系统的影响

2.1.1 对菌落总数和产AHLs活性的影响

pH对A.veroniibv.veronii的菌落总数、产AHLs活性的影响见图1。结果所示，在培养基初始pH值分别为6.0、7.0、8.0时，A.veroniibv.veronii的最大生长总数无显著性差异(p>0.05)，分别为1.29、1.45、1.15×109CFU/mL。由此说明，pH范围为6.0～8.0的培养条件对细菌的生长无显著影响，即细菌生长过程中培养液pH值的变化不影响细菌的生长状态。

图1 不同pH对A. veronii bv. veronii菌落总数和AHLs活性的影响Fig.1 The effects of different pH on the bacterial counts and AHLs activity of A. veronii bv. veronii注：a-b不同字母表示同一指标内差异达到0.05的显著水平。

通过监测报告，菌根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶活性可用来反映A.veroniibv.veroni在不同pH条件下的AHLs活性。如图1所示，当培养环境的初始pH为8.0时，A.veroniibv.veroni培养18 h后的AHLs活性显著低于pH 6.0和7.0下的AHLs活性(p<0.05)。由此推断，碱性环境会降低细菌分泌的AHLs活性。据报道，AHLs的高丝氨酸内酯环在碱性条件下易解环，具有结构不稳定性[15]。綦国红[16]研究了不同pH对AHLs稳定性的影响，发现pH值越高，AHLs的活性越低。

2.1.2 对A.veroniibv.veronii成膜和泳动能力的影响

生物膜是细菌附着在物体表面的细胞及其胞外基质，是细菌产生耐药性的主要原因[17]。在食品工业中，控制细菌生物膜的产生是亟待解决的重要问题。在本实验中，利用结晶紫染色法和CLSM技术测定pH值对细菌成膜的影响，结果见图2和图3。

图2 不同pH对A. veronii bv. veronii生物膜形成能力和泳动能力的影响Fig.2 The effects of different pH on biofilm formation and swimming motility of A. veronii bv. veronii注：a-b不同字母表示同一指标内差异达到0.05的显著水平。

A-pH 6.0；B-pH 7.0；C-pH 8.0；a-荧光照片;b-光镜照片图3 在不同pH下A. veronii bv. veronii生物膜结构的CLSM照片Fig.3 The CLSM images of biofilm structure of A. veronii bv. veronii under different pH

结果显示，在不同pH下，A.veroniibv.veronii的成膜能力受到一定影响。当环境的pH为8.0时，细菌的成膜能力均显著低于pH 6.0、pH 7.0下的两组数据(p<0.05)。由CLSM照片中可以观察到，在pH 8.0时，细胞膜中的荧光强度和细胞密度明显小于pH 6.0和pH 7.0的组别，且细胞膜的结构较为疏松，而pH为6.0和7.0的组别之间差异性较小。这说明，当环境呈碱性时，A.veroniibv.veronii的成膜能力显著低于中性和酸性环境下细菌的成膜能力。这可能是因为在碱性环境下，细菌的QS系统受到影响，产生的AHLs活性降低，从而影响了其介导的生物膜形成能力。这与2.1.1中AHLs的活性变化是一致的。马艳等[18]研究发现,环境pH为7时，菌株的生物被膜形成量最大，被膜中活菌数最多，且生长环境的pH值过低或过高均能够抑制微生物生物被膜的形成。有研究表明，在酸性条件下细菌的胞外分泌物会发生变性，而碱性条件会影响菌体聚集，均不利于生物被膜的形成[19-20]。

同时，pH对A.veroniibv.veronii的泳动能力也有一定影响。泳动是细菌靠鞭毛进行的一种运动模式，指菌体在找到合适的固着位点后在固体平面上扩散，在生物膜形成的早期起着关键作用[21-22]。利用琼脂平板法，将细菌点样在不同酸碱性的平板上静置培养，形成的菌团如图4，直径见图2。结果显示，当环境为pH 8.0时，细菌的泳动能力均显著低于pH 6.0、pH 7.0两组数据(p<0.05)，而pH 6.0和pH 7.0的组别之间无显著性差异(p>0.05)。这与成膜能力的变化结果是一致的，是因为细菌的QS系统在碱性环境下受到影响，从而影响了其介导的泳动能力。目前关于pH对细菌泳动能力的影响还未有相关报道。

图4 平板观察法研究不同pH对A. veronii bv. veronii泳动能力的影响Fig.4 The effects of different pH on swimming motility of A. veronii bv. veronii using agar plates method

2.2 NaCl质量质量浓度对A. veronii bv. veronii QS系统的影响

2.2.1 对菌落总数和产AHLs活性的影响

NaCl质量浓度对A.veroniibv.veronii生长及AHLs活性的影响见图5。由结果可知，在不同NaCl质量浓度(5、10、20 g/L)下，细菌A.veroniibv.veronii培养18 h达到稳定期后的生长最大数分别为1.66×109、7.24×108、1.55×107CFU/mL，且各组数据之间具有显著性差异(p<0.05)。当NaCl质量浓度为5 g/L时，细菌的菌落数最高，随NaCl浓度增加，菌落数减少。由此推断，含盐量为5 g/L的条件更适宜A.veroniibv.veronii的生长。

对不同盐含量下A.veroniibv.veronii的AHLs活性变化分析发现，当NaCl质量浓度为20 g/L时，细菌的AHL活性显著低于NaCl为5 g/L和10 g/L下的AHLs活性(p<0.05)，而在NaCl质量浓度为5 g/L和10 g/L下细菌的AHLs活性无显著性差异(p>0.05)。JAHID等[11]分析了Aeromonashydrophila在不同含盐量下培养24 h后产AHLs和AI-2信号分子的分泌情况，发现A.hydrophila在25 g/L含盐量下信号分子的浓度或活性最高。MEDINA-MARTNEZ等[10]利用ChromobacteriumviolaceumCV026和A.tumefaeiensA136两种报告菌检测了不同含盐量(5～45 g/L)对不同A.hydrophila菌株产AHL的活性影响，发现A.hydrophila在高盐含量下产AHLs活性为阴性，且当培养基含盐量分别高于20、35 g/L时2株报告菌不能检测到细菌的AHLs活性。在本试验中，20 g/L的含盐量减弱了细菌分泌AHLs的能力，因而认为，高含盐量不利于A.veroniibv.veronii分泌AHLs信号分子。

2.2.2 对A.veroniibv.veronii成膜和泳动能力的影响

利用结晶紫染色法和CLSM技术研究不同NaCl质量浓度对细菌成膜能力的影响，结果分别见图6和图7。结果显示，在5 g/L含盐量的条件下，细菌的成膜能力最强，当培养基中含盐量增加时，细菌成膜能力减弱。

图6 NaCl质量浓度对A. veronii bv. veronii成膜和泳动能力的影响Fig.6 The effects of different NaCl concentration on biofilm formation and swimming motility of A. veronii bv. veronii注：a-c不同字母表示同一指标内差异达到0.05的显著水平。

A-5.0 g/L NaCl;B-10 g/L NaCl；C-20 g/L NaCl;a-荧光照片;b-光镜照片。图7 在不同含盐量下A. veronii bv. veronii生物膜结构的CLSM照片Fig.7 The CLSM images of biofilm structure of A. veronii bv. veronii under different NaCl concentration

利用CLSM观察发现，当含盐量为20 g/L时，细菌生物膜的细胞密度较小，且结构较为疏松。这说明培养基质中NaCl质量浓度的变化影响了细菌的QS系统表达，使细菌的成膜能力发生改变。而在马艳等[18]的研究中，当NaCl质量浓度达到20 g/L时，菌株的生物膜形成量最大，活菌数最大。JAHID等[11]研究发现，细菌培养24 h后，其成膜能力在含2.5 g/L NaCl的基质中最强，当含盐量为0或逐渐增加时，细菌的成膜能力显著降低。然而，MCDOUGALD等[23]发现培养基质中营养物质和葡萄糖的含量是影响创伤弧菌生物膜形成的主要因素，而NaCl质量浓度与温度并未影响其生物膜的形成。本实验结果与这些文献报道的差异性可能与细菌的来源和种类不同有关。

利用琼脂平板法研究NaCl质量浓度(5、10、20 g/L)对细菌泳动能力的影响，如图6和图8所示，在20 g/L NaCl的条件下细菌形成菌团直径显著小于5 g/L和10 g/L NaCl下的菌团直径(p<0.05)。细菌的泳动能力是受QS调控的行为，因而该变化与细菌QS在高NaCl下受到影响有关。在本实验中，5 g/L和10 g/L NaCl下的菌团直径大小无显著性差异(p>0.05)。关于环境因素对细菌泳动能力的影响还少有报道。在JAHID等[11]的报道中，细菌的泳动能力在2.5 g/L NaCl条件下最强。

图8 琼脂平板法研究不同NaCl浓度对细菌泳动能力的影响Fig.8 The effects of different NaCl concentration on swimming motility of A. veronii bv. veronii using agar plates method

3 讨论

研究发现，培养基初始pH为pH 8.0时能显著降低细菌合成AHLs的能力、成膜能力及泳动能力(p<0.05),这说明碱性环境能阻碍细菌产生AHLs，进而阻碍QS系统对细菌行为的调控。另外，当培养基中的含盐量为0.5%时细菌的生长菌落数最高；而2.0%的含盐量抑制细菌的生长，并通过干扰细菌的QS系统，抑制了其成膜能力及泳动能力(p<0.05)。由此可见，pH和NaCl质量浓度能影响细菌QS系统及代谢行为的表达，这为通过调控细菌QS来控制水产品微生物安全的新策略提供理论基础。

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