余绪明,余世荣,张晓燕,石金敏,王佳
(湖北医药学院附属人民医院,湖北十堰442000)
同源域蛋白在细胞分化和胚胎发育中起关键作用[1]。Cut同源域蛋白是一个特殊的且由两部分组成的DNA结合同源蛋白。Cut同源域蛋白根据Cut重复单元分为几个亚族[2]。ONECUT属于Cut同源域蛋白家族的一类转录因子,包含1个Cut域和1个同源域。Cut域主要由70个氨基酸组成,主要负责DNA结合[3]。ONECUT1是ONECUT亚家族中重要成员之一,其作为转录因子调控关键靶基因的表达,此外还调节复杂的信号网络并介导复杂的生物学进程[4]。机体内氧化应激失衡导致活性氧(ROS)过度产生,进而引起组织损伤。此外,氧化应激失衡也是某些疾病发生的诱因之一[5]。研究发现,ONECUT1可能是线粒体抗氧化酶系统若干基因的上游调控基因,在调节线粒体抗氧化应激反应中可能发挥关键作用。但ONECUT1与应激之间的相关性尚缺乏系统研究。为进一步探究其生物学功能,2017年3~7月,本研究构建了人源ONECUT1-pcDNA3.1(-)表达质粒,并转染U251细胞,检测细胞应激相关基因的表达,以期为阐明ONECUT1与抗氧化应激基因、内质网应激基因的关系提供依据。
1.1 细胞及试剂来源 U251细胞由武汉大学基础医学院汪晖教授实验室提供;AxyPrep质粒DNA小剂量试剂盒购自AxyGEN;FBS购自杭州四季青公司;DMEM购自武汉启动子生物公司;Penicillin-Streptomycin Solution, 100X购自CORNING;opti-MEM培养基购自Gibco;Lipofectamine 2000购自Invitrogen;TRIzol购自TAKARA;DH5α感受态购自TIANGEN;yeast extrac、Tryptone购自Invitrogen;Ampicillin soidium购自AMRESCO;T4DNA连接酶、EcoRⅠ、HindⅢ购自Invitrogen公司;pcDNA3.1(-)购自湖南优宝生物公司;DNA Ladder购自碧云天生物公司;Agarose购自Sigma;SYBR Premix EX Taq购自TAKARA;I-5TM 2X Hi Fidelity Master Mix购自Molecular Cloning Laboratones;All-in-one cDNA Synthesis SuperMix购自Biotool;GoldViewⅡ型核酸染色剂购自Solarbio;胶回收试剂盒购自BiomiGA。
1.2 U251细胞培养 自液氮罐中取出U251细胞,迅速置于37 ℃水浴中解冻1~2 min,加入含10% FBS、1%双抗培养液10 mL,1 500 r/min离心5 min弃培养基,将细胞接种于培养瓶,于37 ℃、5% CO2培养箱继续培养24 h,当细胞呈单层致密状分布时,PBS洗1~2遍,0.25%胰蛋白酶消化后按1∶3传代,传至第2代用于实验。
1.3 h-ONECUT1质粒构建 根据NCBI给出的ONECUT1 mRNA参考序列(NM_004498.3)设计构建PCR扩增的上下游引物,即上游引物序列为AATGGAATTCATGAACGCGCAGCTGACCATGG (内切酶为EcoRⅠ),下游序列为GGCGAAGCTTTCATGCTTTGGTACAAGTGCTTG(内切酶为HindⅢ)。提取U251细胞总RNA,取1 μg总RNA,加入All-in-one cDNA Synthesis SuperMix 10 μL,RT-PCR扩增获得cDNA样本,扩增条件:25 ℃ 10 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 min。以cDNA样本为模板,用构建的上下游引物RT-PCR扩增ONECUT1全部CDS序列。构建体系:cDNA模板3 μL、Froward primer 2 μL、Reverse primer 2 μL、I-5TM, 2×High Fidelity Master Mix 25 μL,ddH2O 18 μL;条件:98 ℃预变性2 min,98 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,40个循环。1%琼脂糖凝胶电泳,目的基因切胶回收并用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切,酶切产物纯化回收后T4DNA连接酶连接过夜,DH5α感受态进行转化,AMP板子上挑选单克隆并摇菌扩增,提取质粒,重组质粒进行双酶切、RT-PCR鉴定,并进行测序。
1.4 h-ONECUT1质粒转染 将U251细胞接种于6孔板,约(1~2)×105/孔,于37 ℃、5% CO2培养箱培养,待细胞长至40%~60%时进行转染。按照Lipo2000转染说明书进行操作。体外采用opti-MEI优化培养基分别稀释重组h-ONECUT1-pcDNA3.1(-)质粒和pcDNA3.1(-)质粒各4 μg作为A液,将Lipo2000 10 μL加入opti-MEI优化培养基250 μL中作为B液,均室温放置5 min,将A液加入B液混匀,室温放置20 min,即体外重组质粒包装完成。将包装好的重组质粒(转染组)及空载质粒(空载组)分别加入6孔培养板,培养6 h,更换完全培养基继续培养24 h。qRT-PCR法检测显示,U251细胞内ONECUT1升高,转染成功。
1.5 U251细胞ONECUT1、线粒体抗氧化应激相关基因、内质网应激相关基因表达检测 采用qRT-PCR法。转染24 h收集细胞,TRIzol提取总RNA,反转成cDNA样本,-20 ℃保存备用。qRT-PCR检测h-ONECUT1;线粒体抗氧化应激相关基因包括SOD1、CAT、GPX1、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、NRF2、KEAP1、PARK7;内质网应激相关基因包括MANF、PERK、IRE1α和ATF6。引物由武汉擎科生物公司合成,引物序列:ONECUT1上游引物5′AGCGTCGAACTCTACATGCAA3′,下游引物5′TGCTTTGGTACAAGTGCTTGAT3′;Nqo1上游引物5′GAAGAGCACTGATCGTACTGGC3′,下游引物5′GGATACTGAAAGTTCGCAGGG3′;GcLm上游引物5′CATTTACAGCCTTACTGGGAGG3′,下游引物5′ATGCAGTCAAATCTGGTGGCA3′; prdx1上游引物5′CCACGGAGATCATTGCTTTCA3′,下游引物5′AGGTGTATTGACCCATGCTAGAT3′;GcLc上游引物5′GGAGACCAGAGTATGGGAGTT3′,下游引物5′CCGGCGTTTTCGCATGTTG3′;sirt1上游引物5′TGTGTCATAGGTTAGGTGGTGA3′,下游引物5′AGCCAATTCTTTTTGTGTTCGTG3′;CAT上游引物5′CTTCTCCAGTGGCCAGACATG3′,下游引物5′GTCATCAGGGCAAACCTCCTT3′;GPX1上游引物5′TGACTCTACCCACGGCAAGTTCAA3′,下游引物5′ACGACATACTCAGCACCAGCATCA3′;SOD1上游引物5′GAAGAGGTTCTGTGGGGTTT3′,下游引物5′CCTGACTGATATATGTGGCTC3′;NRF2上游引物5′TCCAGTCAGAAACCAGTGGAT3′,下游引物5′GAATGTCTGCGCCAAAAGCTG3′;KEAP1上游引物5′GTGTCCATTGAGGGTATCCACC3′,下游引物5′GCTCAGCGAAGTTGGCGAT3′;PARK7上游引物5′AACCGGAAGGGCCTGATAG3′,下游引物5′GCAAGAGGGTGTGTTGTAACT3′;MANF上游引物5′GCTACTATATCGGGGCCACAG3′,下游引物5′CTTCTTCAGGTCCACTGTGCT3′;PERK上游引物5′GGAAACGAGAGCCGGATTTATT3′,下游引物5′ACTATGTCCATTATGGCAGCTTC3′;IRE1α上游引物5′AGAGAAGCAGCAGACTTTGTC3′,下游引物5′GTTTTGGTGTCGTACATGGTGA3′;ATF6上游引物5′TCCTCGGTCAGTGGACTCTTA3′,下游引物5′CTTGGGCTGAATTGAAGGTTTTG3′;GAPDH上游引物5′CATCACCATCTTCCAGGAGCGAGA3′,下游引物5′TGCAGGAGGCATTGCTGATGATCT3′。扩增体系:Template 2 μL,SYBR Green Mix 5 μL,primer F 0.3 μL,primer R 0.3 μL,dd H2O 2.4 μL;条件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。
2.1 h-ONECUT1质粒构建结果 1%的琼脂糖凝胶电泳结果显示,在DNA Marker 1 000~1 500 bp出现单带,即为插入的全部CDS序列,1 398 bp。测序证实质粒构建成功。
2.2 两组细胞内线粒体抗氧化应激相关基因、内质网应激相关基因表达比较 与空载组比较,转染组线粒体抗氧化应激相关基因CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7表达上调(P均<0.05),SOD1、GPX1、NRF2、KEAP1表达差异无统计学意义(P均>0.05)。与空载组比较,转染组内质网应激相关基因MANF、IRE1α、PERK、ATF6表达差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1、2。
表1 两组线粒体抗氧化应激相关基因表达比较
表2 两组内质网应激相关基因表达比较
ONECUT家族包含哺乳动物肝核因子6(HNF6)[6]、人源OC-2[7]、果蝇D-onecut[8]及海鞘类HrHNF-6[9]。人源ONECUT1主要位于15号染色体上,具有6个外显子,编码含有465个残基的蛋白;其大多分布于肝脏、大脑、皮肤组织中[10],在脑中表达存在区域特异性;进一步研究发现,其利用双向ONECUT同源域序列将蛋白定位于核腔室,并与许多靶基因启动子的特异性DNA序列结合,进而调控靶基因的表达[4]。本研究探讨了ONECUT1与应激之间的相关性,利用重组DNA技术成功敲高U251细胞内ONECUT1。SOD1、CAT、GPX1、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、NRF2、KEAP1、PARK7是体内抗氧化酶系统重要的代表性基因,重要功能之一是维持机体内线粒体氧化应激稳态[11]。CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7可能是ONECUT1的下游靶基因。ONECUT1可能具有抗线粒体氧化应激的功能。MANF是进化上高度保守的分泌型分子,大多数位于内质网腔。MANF是内质网应激反应蛋白,可快速分泌并保护细胞免受内质网应激诱导的死亡。PERK、IRE1α、ATF6均是内质网跨膜敏感蛋白,参与非折叠蛋白反应;在正常细胞中,三者通过结合内质网主要伴侣分子GRP78/Bip,维持着失活状态。当内质网应激时,GRP78从敏感蛋白中分离,随后三者被活化。本研究转染后U251细胞内线粒体抗氧化应激相关基因CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7表达上调,SOD1、GPX1、NRF2、KEAP1表达无变化。内质网应激相关基因MANF、IRE1α、PERK、ATF6表达无变化。提示ONECUT1可能是抗线粒体氧化应激基因,在调节线粒体氧化应激稳态中可能发挥关键作用;ONECUT1与内质网应激无关,ONECUT1在体内可能不参与内质网应激反应[12]。
本课题组后续研究拟采用RNAi干扰技术,敲低U251细胞内ONECUT1,检测细胞内CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7的表达。以期进一步阐明ONECUT1的抗线粒体氧化应激的生物学功能。
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