纯合等臂假双着丝粒X染色体致性腺发育不良1例病例报告与文献复习

李能干，范新萍，赵荣，李培，谭姿辉，刘家恩，李存玺*

（1北京家恩德运医院家恩遗传实验室，北京 100191；2首都医科大学附属北京朝阳医院，北京100020；3北京家恩德运医院妇产科，北京 100191）

女性2条X染色体中，其中1条发生等臂双着丝粒重排，会导致X染色体短臂及着丝粒至长臂断点部分的片段局部三体与X染色体长臂断点至长臂末端的片段局部单体。除了等臂双着丝粒X染色体的细胞系之外，该类患者还可能嵌合携带45，X及46，XX细胞系。等臂双着丝粒X染色体在其长臂上的断点常见于Xq13、Xq21、Xq22、Xq27、Xq28等。由于嵌合程度以及断点位置的不同，患者的临床特征从正常女性、不同程度的特纳综合征特性，到严重的性腺发育不良（包括卵巢子宫完全缺如等）等。我们发现1例14岁女性特纳综合征体貌较为明显，染色体分析提示纯合46, X, psu idic(Xq)核型，染色体荧光原位杂交（FISH）及微阵列芯片技术（chromosome microarray assay, CMA）检测确证携带等臂假双着丝粒X染色体。

对象与方法

1 病历

患者，女，14岁，身高140cm，于2014年8月因第二性征发育迟缓就医。B超结果示盆腔未见子宫样回声（图1A），双侧卵巢缺如（图1B）。在本院遗传咨询中，发现患者特纳综合征体貌明显，考虑性染色体异常的可能性，建议进一步检测确认。

2 染色体核型检测

在患者及家属知情同意的原则下，无菌抽取外周血3ml，肝素锂抗凝。将适量外周血样本接种到外周血专用HD培养基内，5% CO2，37℃培养72h。收获细胞前用0.2µg/ml秋水仙素处理20min；离心去上清液，低渗处理15min；固定 (乙酸∶甲醇=1∶3)，离心去上清液，加新鲜固定液制成细胞悬液。将细胞悬液滴在洁净湿冷的玻片上，风干后移入烤箱，90℃烘烤2h。经过胰酶消化、吉姆萨染色，加盖玻片晾干。细胞遗传学分析用HD系列试剂均为北京家恩遗传实验室自制。将制备好的玻片用Leica全自动玻片扫描系统GSL-120扫描拍摄，获得分散的分裂中期染色体图像。用CytoVision软件辅助分析判读中期细胞，核型分析，归纳结果。

图1 患者盆腔超声检测。A，未见子宫样回声；B，双侧卵巢未显示Fig.1 Ultrasound examination of the patient’s pelvis. A, no uterine echo; B, no bilateral ovaries echo

3 染色体荧光原位杂交

为确认核型分析发现的X染色体异常，对含中期和间期的混合细胞悬液用X染色体着丝粒探针Xcen进行FISH验证 。悬浮细胞常规滴片，风干，95℃，5min烤片；37℃ 2×SSC，3 min，两次；70%、85%、100%乙醇顺序脱水各1min，室温晾干；浸入70%甲酰胺（预热），73℃，5min；玻片70%、85%、100%乙醇顺序脱水各2min，室温晾干；加探针Vysis X-green 3µl样本区域/玻片；加10mm圆盖片，塑料水泥密封；杂交：37℃湿盒、避光、过夜；洗片：0.4×SSC/0.3% NP-40，73℃，2 min；2×SSC，30s；70%、85%和100%乙醇顺序脱水各1min，室温晾干；风干，4µl DAPI，加22mm×22mm盖片，指甲油封片；在荧光显微镜下观察信号。

4 染色体微阵列芯片分析

使用 QIAamp DNA Blood mini kit（Qiagen，DEU）试剂盒提取外周血基因组 DNA，所得DNA样本使用Nanodrop 2000 （Thermo，USA）进行质控检测，并稀释至50ng/µl后待检。选用包含260万个拷贝数标记探针和75万个单核苷多态性（SNP）探针的CytoScan HD (Affymetrix，USA)芯片，对DNA进行检测。按照Affymetrix公司的标准操作流程，对样本进行酶切、连接、扩增、扩增产物质控、纯化、定量、片段化、片段化产物质控以及标记操作。标记产物注入芯片后，50℃，60r/min杂交16h后进行洗涤和染色。染色后芯片扫描完成后，利用Chromosome Analysis Suite (ChAS)软件行对所得数据进行分析（参见制造商操作说明书）。

结 果

1 1条等臂假双着丝粒X染色体核型

患者外周血样本经过72h培养，制片拍摄200个中期分裂相细胞。详细分析 100 个中期分裂相细胞。发现1个纯合的异常克隆，其特征为：1条X染色体以其长臂2区2带1亚带为断点，包含着丝粒的一侧发生复制并形成等臂双着丝粒染色体，其中一个着丝粒膨大失活。结果导致Xpter-Xq22.1局部三体，Xq22.1-Xqter局部单体（X染色体长臂片段缺失）（图2A）。ISCN格式的核型书写为：46，X，psu idic(X)(q22.1)[100]。

2 存在3个X染色体着丝粒，其中2个在同一条染色体上

为了确认核型分析发现的X染色体异常，对含中期和间期的混合细胞用X染色体着丝粒探针Xcen进行了FISH验证。结果显示，间期细胞中，均可见3个X染色体着丝粒信号；中期细胞中，同样可见3个X染色体着丝粒信号，其中2个信号位于同一条染色体上（图2B）。按照ISCN规则，FISH临床报告为：ish idic(X)(q22.1)(DXZ1++)[20].nuc ish(DXZ1×3)[200]。

3 X短臂末端至长臂q22.1重复、长臂q22.1至长臂末端缺失

图2C展示被检者CMA检测结果所得的虚拟染色体女性核型，红色标记提示单拷贝缺失区，蓝色标记提示重复区。结果显示，X染色体短臂pter至 长 臂 q22.1（chrX：168546-99842711 ×3）重复。X染色体长臂q22.1-qter（chrX：99842717-155233846 X1）缺失。此结果与核型分析所见的X染色体发生等臂假双着丝粒重排相符。CMA结果显示断裂和连接点可能位于Xq22.1区域内的99842711 和99842717（CAATGAC）2个C碱基之间的5个碱基中。按照ISCN规则，CMA结果为：arr[hg19] Xp22.33q22.1(168,546-99,842,711)×3,X-q22.1q28(99,842,717-155, 233,846)×1。

图2 染色体核型、FISH及CMA。A，核型分析：左侧为患者X染色体，红色箭头示idic(X)的断点，右侧为对应的550条带水平(bands per haploid set，简称bphs)的染色体模式图；B，间期细胞和中期细胞的FISH检测，绿色为X染色体着丝粒探针信号；C， CMA，示X短臂末端至长臂q22.1局部三体、长臂q22.1至长臂末端局部单体Fig.2 Karyotyping, FISH, and CMA results of the chromosomes. A, karyotyping∶ on the left was the structure of idic(X) , the breakpoint of idic(X) was pointed by the red arrow; on the right was the schematic diagram at the corresponding 550 bphs level; B, FISH examination of interphase and metaphase cells, the green signals indicating centromeres probe signals in the X chromosome; C, CMA showing the trisomy of Xpter-Xq22.1 and monosomy of Xq22.1-Xqter

讨 论

典型特纳综合征(Turner syndrome, TS)患者的染色体核型是45,X，约占50%。TS有多种变种，除1条正常的X染色体外，另一条X染色体并非丢失，而是发生结构畸变，包括del(X)、r(X)、idic(X)、i(X)、X与常染色体的平衡易位等等。TS变种中的异常细胞系可以是纯合的，也可能伴随45,X或46,XX细胞系成为嵌合体。核型为idic(X)的TS患者非常少见，在活产女婴中发生率约为1/13 000，多数以45,X/46,X,idic(Xq)嵌合形式出现[1-6]。纯合idic(Xq)的患者相对更少[7-9]。对本例患者100个中期淋巴细胞进行分析，核型结果为纯合的46,X,psu idic(X)(q22.1)。

一般来说，idic(Xq)导致X染色体整条短臂及部分长臂局部三体，位于Xpter的PAR1区（Pseudoautosomal region 1）内的SHOX基因剂量比正常女性细胞增加了50%，常导致携带者身高偏高[10]。Seo等报道一例30岁携带46,X,psu idic(X)(q21.2)核型患者，身高达到190cm[9]。Nishi等报道一例16岁患者，核型为45,X/46,X,psu idic(X)(pter→q21∶∶q21→pter) ，身高183cm[5]。但SHOX基因的剂量效应并非绝对，常与雌激素水平共同决定患者身高[10]。Tsai等报道一例9岁患者，核型46,X,idic(X)(q24)，身高143cm，身高在正常范围内[8]。Tsutomu等也报道一例20岁患者，核型45,X[28]/46,X,psu idic(X)(q28)[72]嵌合体，三倍型SHOX基因占72%，身高162cm[4]。国内马洪星等报道一例17岁患者，核型为45,X[29]/46,X,psu dic(X)(q22)[21]的嵌合体，身高150cm，两侧乳房未发育，卵巢未探及，子宫发育不良[6]。Van等报道的两例患者核型均为46,X,psu idic(X)(q21.1)，一人13岁身高141cm，另一人12岁半身高142cm，均低于正常水平[7]。Xq局部三体与单体，还影响到位于Xq13.2上的X染色体去活化中心(X inactivation center, XIC)以及XIST基因的拷贝数，而XIST基因的完整性对异常X染色体的灭活状态有决定作用[7,11]。本例携带纯合46,X,psu idic(X)(q22.1)核型，3倍型SHOX基因，无45,X细胞系嵌合，身高偏矮。因此，评估idic(X)患者身高和生殖能力，不仅考虑SHOX基因的倍数，还必须确定是否嵌合45,X细胞和是否影响XIST的X染色体灭活活性。

X染色体长臂Xq13-q22、Xq22-q26被认为是女性性腺发育的两个关键区[11,12]，本例患者X染色体形成等臂衍生染色体导致的长臂片段缺失，覆盖了第二个关键区，可能是患者性腺发育不良的直接原因。

当G显带核型分析的显带水平达到550条带，idic(X)结构畸变并不难检出。如果染色体显带水平过低，则可能发生漏诊和误诊，需要结合FISH或CMA方可保证诊断的正确率。在新生儿阶段，甚至在产前诊断中尽早发现idic(X)等X染色体异常，患者便可以在医生指导下，使用重组人生长激素 (recombinant human growth hormone，rhGH)、促性腺激素释放激素类似物(gonadotrophins releasing hormone analog，aGnRH)等[13]，促进性腺发育、改善第二性征，可能极大提高患者的生活质量。