广州市番禺区丙型肝炎患者病毒基因型与病毒载量的相关性分析

黄雪琼，吴普昭，黄诚记

(广州市番禺区中心医院检验科，广东 广州 511400)

丙型肝炎病毒是一种经血液传播引起慢性肝脏疾病的RNA病毒，其核酸是单股、线性、正链RNA。由于HCV-RNA复制所依赖的聚合酶缺乏校正功能，HCV基因组呈现高度特异性[1]。根据不同区域的基因序列变异情况，HCV分为6个基因型和80多种基因亚型。不同HCV基因型感染者的临床表现、肝病严重程度及慢性化病程进展均有差异，抗病毒治疗的效果也不同[2]，近年来的研究表明，HCV的基因型与丙型肝炎的治疗方案及治疗周期关系密切[3，4]。本文通过统计分析番禺地区丙型肝炎患者病毒基因型及基因型与病毒载量的相关性，以了解本地区丙型肝炎患者的病毒基因型构成状况及为个体化抗病毒治疗方案提供参考依据。

1 对象与方法

1．1 研究对象 2016年在广州市番禺区中心医院门诊和住院所有HCV-RNA阳性的丙型肝炎患者，共收集125例病例。

1．2 标本采集 空腹静脉采血3ml，3000r/min离心5min；吸取上层血清立即检测或置于1．5ml经高温高压灭菌处理的EP管内，-70℃保存待测。

1．3 仪器和试剂 ABI 7500 Real Time PCR system实时荧光PCR检测仪，YN-H16分子杂交仪、GELDOCXR+凝胶成像分析仪。丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒和丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒，均购于中山大学达安基因股份有限公司。

1．4 血清HCV-RNA定量检测 严格按照丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒操作说明书和实验室操作规程对血清标本进行HCV-RNA定量检测。

1．5 HCV 基因分型检测

1．5．1 HCV-RNA提取 严格按照丙型肝炎病毒基因分型核酸提取试剂盒操作说明书提取血清标本HCV-RNA，并对已提取的病毒核酸溶液立即进行扩增。

1．5．2 RT-PCR扩增 取PCR反应管，加入反应试剂和30ul已提取的病毒核酸溶液，滴加矿物油后瞬时离心封闭。按反应条件进行扩增：50℃逆转录25min，95℃预变性 15min，94℃ 30s→ 55℃ 40s→72℃45s进行45个循环扩增，最后72℃延伸7min。

1．5．3 杂交反应 将预先经过 98℃变性 10min、随后立即冰浴冷却的PCR产物加入已放有杂交膜条的杂交管中，低速转动（100～150r/min），50℃杂交60min。杂交完成后进行洗膜、显色，用凝胶成像分析仪扫描记录结果。结果如图1。

图1 HCV基因分型结果示意图。

1．6 统计学方法 采用SPSS 17．0软件进行统计分析。定量资料以表示，1b型与非1b型病人血清HCV-RNA载量比较采用t检验，1b型与非1b型低病毒载量水平与中高病毒载量水平的人数比例比较采用卡方检验。检验水准：a=0．05，以 P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 番禺区丙型肝炎患者丙肝病毒基因型构成状况 125例HCV-RNA阳性样本中，检测出1b、2a、3a、3b、6a，5种基因型。其中1b型为比例最大的基因型，占 48．0%（60/125）；其次为 6a 型，占 27．2%（34/125）； 其余 2a 型占 8．0%（10/125），3a 型 占10．4%（13/125），3b 型占 6．4%（8/125）；详见表 1。

表1 番禺区丙型肝炎患者HCV基因型构成状况

2．2 丙肝病毒基因型与病毒载量的相关性

2．2．1 由于 1b 型占 48．0%，为本地区主要基因型，因此采取对1b型组和非lb型组之间HCV-RNA载量进行比较，结果 t=2．417，P＜0．05。 两者病毒载量差异有统计学意义，1b型患者HCV-RNA载量高于非1b型患者，见表2。

表2 1b型与非1b型血清病毒载量的比较

2．2．2 按照血清HCV-RNA载量分为低病毒载量组＜105（log10 拷贝/ml）、中高病毒载量组＞105（log10拷贝/ml），1b型与非1b型例数及比例见表3。通过卡方检验比较低病毒载量组与中高病毒载量组病人比例，结果 χ2=4．159，P＜0．05，比较有统计学意义。在低病毒载量比较中1b型病人所占比例小于非1b型，中高病毒载量比较中1b型病人比例大于非1b型。

表3 1b型与非1b型在不同病毒载量水平的病例数比较

3 讨论

全球约有1．3亿～2．1亿人感染丙型肝炎病毒(HCV)，我国一般人群HCV感染率为0．43%，约有1300万人口抗-HCV阳性，是世界上HCV感染人口数最多的国家。丙肝病毒是肝细胞癌的主要危险因素之一，从全球范围来看，至少有三分之一的肝细胞癌是由HCV引起的，每年约有35万人死于丙肝相关疾病[5]，丙肝防治形势严峻。

丙型肝炎病毒是单股正链RNA病毒，属黄病毒科。由于该病毒为RNA病毒，易发生基因变异，根据核苷酸同源性分析，HCV遗传变异性可分为6种基因型，每组基因型又分别可以分为多种基因亚型。因地域不同，HCV基因型在不同地区存在很大差异，基因分型不仅有助于了解相关HCV演变及流行分布，也有助于了解丙型肝炎的危险因素以及肝脏疾病的进展情况，HCV基因分型在流行病学研究和临床治疗上均有重要作用[6]。广州地区最广泛流行的丙型肝炎病毒分型是1b型，其次为6a型，1b型也是全世界最主要的流行类型，和世界大流行的环境相似；1b型的丙型肝炎易形成慢性肝炎，不易根治，并有可能发展成肝癌，对社会的危害性大[7]。广州地区6a型丙型肝炎病毒流行是因为毗邻香港和澳门，以及东南亚等6a型分布广泛的地区，这些地区的人口与广州地区相互交流频繁，使广州地区6a型丙型肝炎流行呈逐渐增加趋势。6a类型的丙型肝炎较容易治愈，不容易发展成慢性肝炎[8]。因此，检测HCV基因型有助于判断治疗的难易程度、制定个体化的资料方案[9]。

番禺地区2016年收集的125例丙型肝炎病毒阳性患者当中，1b型为主要类型，占48．0%，肖桂娥等在广州地区2014年检测1b型比例为40．78%[10]，本次研究结果与广州结果相近，也与广东乃至全国平均水平相符。番禺地区丙型肝炎病毒基因6a型的比例达到了27．2%，高于全国平均水平，这是由于广州番禺属于东南沿海毗邻香港，澳门以及东南亚6a类型广泛流行的地区，人员交流频繁导致。相比粤东地区2007-2010年6a型比例为17．9%，说明番禺与广东其他地区情况类似但更为严重[11，12]。大量研究表明，1b型丙肝病毒导致的丙型肝炎在临床上是较为难治的类型，这提醒我们番禺地区丙肝临床治疗形式不容乐观。

由于本地区1b类型患者比例较大，且临床上也较其他基因型容易转变成为慢性丙肝难以治愈，因此我们主要研究1b型与非1b型之间的病毒载量差异[13，14]。通过独立样本t检验，比较1b型与非1b型患者血清HCV-RNA载量，结果显示1b型与非1b型病毒载量之间差异性有统计学意义，1b类型的丙型肝炎病毒载量平均值为5．87±1．05（log10拷贝/ml）， 高于非 1b类型的平均值 5．36±1．34（log10 拷贝/ml）；另外通过对 1b 型与非 1b 型患者血清HCV-RNA在低病毒载量水平与中高病毒载量水平的人数比例作比较，用卡方检验显示1b型患者中高病毒载量水平的人数比例大于非1b型。从患者血清病毒载量方面反映番禺地区1b类型的丙型肝炎病人的病情要比非1b类型的严重，与临床上1b类型较难治愈和易形成慢性肝炎的临床特点相符[15]。

本次研究，了解到广州番禺地区丙型肝炎病毒基因型的构成特点和分析丙肝病毒基因型与病毒载量的相关性，结果提醒我们目前防治丙肝1b型形势依然严峻，临床应根据不同基因型病毒特点制定个体化治疗方案。

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