乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液制备及其质量评价

汪慧超 钱 宇 薛秀恒 徐霞红

(安徽农业大学茶与食品科技学院1，合肥 230036) (安徽省农产品加工工程实验室;皖江合肥农产品加工研究院2，合肥 230036)

甘油二酯(diacylglycerol，DG)，是一种甘油骨架上只有两个高级脂肪酸的油脂，属于一般公认安全(GRAS)物质[1]，在天然油脂中含量很低。1,3-甘油二酯为甘油二酯两种不同异构体中的一种，脂肪酸酰基与甘油骨架中羟基形成间隔酯键。研究表明，1,3-甘油二酯具有降低血脂[2-3]、缓解糖尿病[4]、抗氧化[5]等作用。在美国、日本等国，1,3-甘油二酯已被允许作为烹调用油或食品添加剂使用[6]。但在国内关于1,3-甘油二酯在食品中应用的报道较少，且1,3-甘油二酯极易被氧化，不易贮藏，对其在食品中的应用造成很大的影响。因此，有必要使用特殊的方法，提高1,3-甘油二酯的抗氧化性，保证其在食品中的活性成分不被破坏。

纳米乳液主要是由水、脂溶性芯材、水溶性壁材和乳化剂等组成成分，按一定比例在特定条件下混合形成的分散体系，对于易于氧化水解的功效成分具有良好的保护作用，还可提高其生物利用度。水溶性壁材主要有蛋白质、多糖等，而脂溶性芯材主要有脂溶性维生素、营养素、精油、风味油脂等。纳米乳液的制备可分为高能乳化法和低能乳化法，高能乳化法[7]主要包括高压均质法、高压微射流和超声波法，而低能乳化法[8]主要包括自发乳化法和相转变法。高能乳化法是制备纳米乳液最常用的方法，可用于大规模的工业化生产，且适用于大多数材料，而高压均质法是高能乳化法中使用最普遍的一种。

本研究采用高压均质法，以乳清蛋白为壁材，1,3-甘油二酯为芯材，采用响应面分析法优化乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液的制备，并对其表面性质、表征及温度、氧化、贮藏稳定性进行研究，为乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液在食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清蛋白粉：美国唐瑞斯食品物料公司；蔗糖酯SE-11：河南千志商贸有限公司；正己烷(色谱纯)、异丙醇(色谱纯)：国药集团化学试剂有限公司；富含1,3-甘油二酯乳脂：实验室自制。

1.2 主要仪器与设备

高速分散器：上海FLUKO有限公司；超高压纳米均质机：德国APV2000公司；Zeta电位及纳米粒度测定仪：英国Malvern公司；OXITEST油脂氧化分析仪：意大利VELP公司；高效液相色谱仪：美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液的制备

采用高压均质法制备纳米乳液。将乳清蛋白粉加入蒸馏水中搅拌至完全溶解，制得乳清蛋白溶液；再将乳脂甘油二酯与乳化剂蔗糖酯混合，在50 ℃水浴中搅拌直至完全溶解，得到混合物；然后将乳清蛋白溶液缓慢倒入混合物中，边倒边搅拌，得到混合乳液；最后将混合乳液2 000 r/min高速分散3 min，并在超高压纳米均质机中进行均质，得到乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液。

1.3.2 乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液制备的单因素实验

按操作步骤制备乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液，以纳米乳液的粒径和包埋率为综合评价指标，分别考察不同壁材浓度(占蒸馏水的百分比：5%、10%、15%、20%、25%)、不同壁芯比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、不同乳化剂添加量(占总固形物含量的百分比：0，2%、4%、6%、8%)、不同均质压力(30、60、90、120、150 MPa)、不同均质循环次数(2、6、10、14、18)对纳米乳液制备的影响。

1.3.3 乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液制备的响应面实验

为确定乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液的最佳配方，在单因素实验的基础上，固定高压均质的压力与循环次数，采用Box-Behnken设计，以壁材浓度、壁芯比、乳化剂添加量为因素，以包埋率响应值，进行响应面实验，优化乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液制备的工艺参数，因素水平编码如表1所示。

表1 响应面实验因素水平编码表

1.3.4 乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液的评价指标1.3.4.1 纳米乳液粒径及Zeta电位的测定

采用Zeta电位及纳米粒度测定仪测定乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液的粒径及表面电位。

1.3.4.2 纳米乳液包埋率的测定

采用高效液相色谱仪分别对纳米乳液的表面油及总油进行测定，并按公式计算。

表面油的测定：取制备好的纳米乳液，加入正己烷/异丙醇(15∶1)，反复萃取后合并有机相并定容，用高效液相色谱法测定乳脂甘油二酯含量。

总油的测定：将制备好的纳米乳在超声波细胞破碎仪中破乳后，加入正己烷/异丙醇(15∶1)，反复萃取后合并有机相并定容，用高效液相色谱测定乳脂甘油二酯含量。

高效液相色谱条件：流动相为正己烷/异丙醇(15∶1)，流速1 mL/min，柱温35 ℃，色谱柱为Luna silica C18(5 μm，250×4.6 mm，Phenomenex)。使用示差检测器进行检测，检测器温度35 ℃。实验结果通过峰的峰面积来定量测定。

1.3.5 乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液的质量评价1.3.5.1 透射电镜

采用JEM-100SX型透射电镜对纳米乳液的粒径及分布情况进行测定。取一定量的样品滴于干净的铜网表面，经1%磷钨酸染色后自然风干，并利用透射电镜进行观察。

1.3.5.2 红外光谱

采用傅里叶红外光谱仪进行测定，在4 000～400 cm-1范围内进行扫描。

1.3.5.3 温度稳定性

将制备好的纳米乳液分别放置于20、30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴锅中加热30 min，然后在室温中静置12 h，测定纳米乳液的粒径和包埋率。

1.3.5.4 氧化稳定性

利用OXITEST油脂氧化分析仪对乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液的氧化稳定性进行测定。

1.3.5.5 贮藏稳定性

将制备好的纳米乳液分别放置于4 ℃(冷藏)、25 ℃(常温)、37 ℃(体温)贮藏1个月，每隔5 d取样测定其包埋率，研究不同贮藏温度对纳米乳液稳定性的影响。

1.4 数据分析

利用Design-expert 8.05和Origin Pro 9.0软件对数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 壁材浓度对纳米乳液制备的影响

在固定壁芯比为3∶1，乳化剂添加量为4%，均质压力为90 MPa，均质循环次数为10次时，不同壁材浓度对纳米乳液制备的影响如图1所示。从图1可以看出，随着壁材浓度的升高，纳米乳液的粒径先减小后增大，包埋率先增大后减小，在壁材质量分数为15%时，粒径与包埋率均达到最值。由于乳清蛋白本身具有一定的乳化性，随着壁材浓度的升高，纳米乳液的乳化作用增强，有利于纳米乳液中纳米颗粒的形成，包埋率较高，当壁材浓度过高时，体系黏度过大，不利于分散，导致包埋率降低，粒径增大。因此，选择15%为壁材最佳质量浓度。

图1 壁材浓度对纳米乳液制备的影响

2.1.2 壁芯比对纳米乳液制备的影响

在选择壁材质量分数为15%的基础上，固定乳化剂添加量为4%，均质压力为90 MPa，均质循环次数为10次时，不同壁芯比对纳米乳液制备的影响如图2所示。从图2可以看出，随着壁芯比的增大，纳米乳液的粒径先迅速减小后缓慢减小，包埋率先增大后减小，在壁芯比为2∶1～4∶1时包埋率增加趋势最大，在壁芯比为4∶1时，包埋率达到最大值。开始时，芯材过多，壁材不足，不能很好的包被乳脂甘油二酯，粒径较大，包埋率较低。随着壁芯比的增大，芯材含量逐渐减少，纳米乳液粒径逐渐减小，包埋率逐渐升高，包被效果较好。但当壁芯比过大时，芯材含量过少，反而导致包埋率的下降。因此，壁芯比为4∶1时，纳米乳液效果最佳。

图2 壁芯比对纳米乳液制备的影响

2.1.3 乳化剂添加量对纳米乳液制备的影响

在选择壁材质量分数为15%、壁芯比为4∶1的基础上，固定均质压力为90 MPa，均质循环次数为10次时，不同乳化剂添加量对纳米乳液制备的影响如图3所示。随着乳化剂的增多，纳米乳液的粒径先减小后增大，包埋率先升高后降低，均在乳化剂添加量为4%时达到最值。添加一定量的乳化剂能提高纳米乳液的乳化性能，有助于纳米乳液中纳米颗粒的形成，但添加量过多时，反而导致粒径增大，包埋率降低。因此以乳化剂添加量4%为最适添加量。

图3 乳化剂添加量对纳米乳液制备的影响

2.1.4 均质压力对纳米乳液制备的影响

在选择壁材质量分数为15%、壁芯比为4∶1、乳化剂添加量4%的基础上，固定均质循环次数为10次时，不同均质压力对纳米乳液制备的影响如图4所示。从图4可以看出，随着均质压力的增大，纳米乳液的粒径先迅速减小，后缓慢增大，在90 MPa时粒径最小。纳米乳液包埋率先升高后降低，也在90 MPa时达到最大值。均质压力的增大，可使纳米乳液在超高压均质过程中混合得更均匀，被分散成更小的颗粒，使纳米乳液粒径减小，包埋率增加。但均质压力过高时，可能会导致纳米乳液被破坏，且部分纳米颗粒会发生聚合，反而导致粒径增大，包埋率降低。因此90 MPa为最佳的均质压力。

图4 均质压力对纳米乳液制备的影响

2.1.5 均质循环次数对纳米乳液制备的影响

在选择壁材质量分数为15%、壁芯比为4∶1、乳化剂添加量4%、均质压力为90 MPa的基础上，不同均质循环次数对纳米乳液制备的影响如图5所示。由图5可知，随着循环次数的增多，纳米乳液的粒径开始时迅速减小，后减小速度极慢，基本保持平衡。包埋率先增加，后逐渐减小，在循环次数为6次时，包埋率最大。高压均质循环一定的次数可使纳米乳液混合更加均匀，粒径分布更加集中，包埋效果更好。但循环次数过多时，机器温度过高，会对纳米乳液造成一定的破坏，导致包埋率迅速降低。综合考虑，最佳高压均质循环次数为6次。

图5 均质循环次数对纳米乳液制备的影响

2.2 响应面实验

2.2.1 响应面实验结果

根据Box-Behnken design实验设计原理，以壁材浓度、壁芯比、乳化剂添加量为自变量，乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液的包埋率为因变量，利用响应面分析法优化乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液的配方，实验设计及结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果

对实验数据进行分析，得到响应面回归模拟方程：

Y=73.94+5.26A-4.35B-2.66C+2.35AB-1.17AC-5BC-11.26A2-3.08B2-25.16C2

由表3可知，模型的P值<0.000 1，说明该模型极显著，失拟项P值为0.068 1>0.05，不显著，说明该模型能很好的拟合实验的真实情况，可以用于乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液工艺的优化。通过方差分析结果可知，壁材浓度、壁芯比及乳化剂添加量对纳米乳液包埋率的影响均极显著。而在交互作用中，壁材浓度和壁芯比的交互作用显著，壁芯比及乳化剂添加量的交互作用极显著。

表3 回归方程方差分析表

注:**表示差异极显著；*表示差异显著。

2.2.2 响应面实验因素间交互作用分析

将响应面实验中一个因素设为零水平，其他两个因素交互作用的响应面及等高线图见图6和图7。

图6为壁材浓度和壁芯比交互作用对乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液包埋率的影响。当壁材浓度固定时，随着壁芯比的增大，纳米乳液包埋率先升高后降低；当壁芯比保持一定时，随着壁材浓度的增加，纳米乳液包埋率也呈现先升高后降低的趋势。壁材浓度和壁芯比交互作用等高线图呈椭圆形，表明在实验设定的壁材浓度和壁芯比区间内，存在最大交互区间。

图7为壁芯比和乳化剂添加量交互作用对乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液包埋率的影响。从图7中可以看出，响应面坡度较陡，壁芯比和乳化剂添加量交互作用极显著。当壁芯比保持一定时，随着乳化剂添加量的增加，纳米乳液包埋率呈先升高后降低的趋势；当壁芯比固定时，随着乳化剂添加量的增大，纳米乳液包埋率也呈现先升高后降低。壁芯比和乳化剂添加量交互作用等高线图也呈椭圆形，表明在实验设定壁芯比和乳化剂添加量区间内，存在最大交互区间。

图6 壁材浓度和壁芯比交互作用响应面图及等高线图

图7 壁芯比和乳化剂添加量交互作用响应面图及等高线图

2.2.3 最佳工艺条件的确定及验证

根据模型预测结果，乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液的最佳工艺条件为：壁材质量浓度15.83%，壁芯比3.35∶1，乳化剂添加量4.02%。按上述条件制备乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液，经3次重复实验，制得的纳米乳液的包埋率为75.5%，与理论值75.776 5%接近，实际测定值与预测的理论值之间相对误差较小，因此，基于响应面法得到的工艺条件是可行的，有实用价值。

2.3 纳米乳液粒径及Zeta电位的测定

通过Zeta电位及纳米粒度测定仪对乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液进行测定，其粒径及分布情况如图8所示。由图8可知，纳米乳液粒径呈正态分布，大部分集中在100 nm左右。乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液Zeta电位、平均粒径及PDI分散指数见表4。由表4可知，纳米乳液的Zeta电位在-23 mV左右，带负电荷，平均粒径在142 nm左右，PDI指数在0.238左右，表明制得的纳米乳液粒径分布均匀。

图8 乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液粒径及分布情况 表4 纳米乳液Zeta电位、平均粒径及PDI分散指数

项目Zeta电位/mV平均粒径/nmPDI1-22.79142.20.2342-23.06140.50.2383-23.70143.70.2394-23.77141.80.2385-23.55142.60.239

2.4 纳米乳液的表征

2.4.1 透射电镜

乳清蛋白及纳米乳液的透射电镜结果如图7所示。从图7中可以看出，经过均质处理后的乳清蛋白粒径较小，仅为几十纳米，形状不规则。乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液呈现近似球形，中间芯材甘油二酯部分较亮，粒径为80～200 nm左右，纳米乳液中纳米颗粒具有明显的海岛状壳核结构，表明包被效果较好。

图9 乳清蛋白及纳米乳液的透射电镜图

2.4.2 红外光谱

图10 纳米乳液(a)、乳清蛋白(b)及甘油二酯(c)的红外光谱图

2.5 稳定性实验

2.5.1 温度稳定性

不同温度处理对纳米乳液粒径及包埋率的影响如图11所示。随着处理温度的升高，纳米乳液的粒径略微升高，但是总体基本保持平衡；包埋率逐渐降低，在20～80 ℃下降速度较慢，但在80 ℃之后包埋率下降迅速，可能是由于处理温度较高，对纳米乳液造成一定的破坏，导致包埋率迅速降低。因此，在80 ℃以下，纳米乳液相对较稳定。

图11 不同温度处理对纳米乳液粒径及包埋率的影响

2.5.2 氧化稳定性

纳米乳液的氧化稳定性经OXITEST油脂氧化仪测试结果如图12所示。从图12中可看出，乳脂甘油二酯在较短的时间内急剧氧化，在20 h趋于氧化完全，20 h以后氧压下降极缓慢，基本处于平衡状态。而经超高压纳米均质处理的乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液氧化速度则非常缓慢，氧化稳定性较好，经400 h氧化，氧压只下降1.5左右，仍未被氧化完全。因此，乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液能提高甘油二酯的氧化稳定性，利于保藏。

图12 纳米乳液的氧化稳定性

2.5.3 贮藏稳定性

不同贮藏温度对纳米乳液包埋率的影响如图13所示。由图13可知，在30 d贮藏时间内，随着时间的延长，纳米乳液包埋率逐渐降低。但温度越高，包埋率下降速度越快，温度较低时，包埋率下降缓慢。说明贮藏温度对纳米乳液品质的影响较大，长期高温贮藏会导致纳米乳液被迅速破坏，包埋率降低，影响纳米乳液的使用及作用效果。因此，该纳米乳液应在4 ℃低温贮藏。

图13 不同贮藏温度对纳米乳液包埋率的影响

3 结论

乳清蛋白-甘油二酯纳米乳液的最佳工艺条件为：壁材质量浓度15.83%，壁芯比3.35∶1，乳化剂添加量4.02%，此时，纳米乳液的包埋率最高，为75.5%。纳米乳液带负电，分布均匀，粒径在142 nm左右，有明显的壳核结构，包被效果较好。纳米乳液在80 ℃以下具有较好的稳定性，且能有效延缓甘油二酯的氧化，最佳贮藏温度为4 ℃。

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