IBDV分离株JS7的VP3基因的分子特征及其原核表达

何 晨， 武秀知， 王 浩， 何秀苗，2

(1.广西民族大学海洋与生物技术学院/广西高校微生物与植物资源利用重点实验室，广西南宁 530006 2.广西民族大学/广西多糖材料与改性重点实验室培育基地，广西南宁 530006)

传染性法氏囊病(IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的以危害青年鸡为对象的烈性、高度接触传染性的病毒病[1]。IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，IBDV基因组由A、B等2个节段组成，A节段编码病毒的结构蛋白VP2、VP3，以及病毒的蛋白酶VP4、非结构蛋白VP5，B节段编码具有RNA依赖聚合酶活性的VP1蛋白[2]。VP3是IBDV的主要结构蛋白之一，含有IBDV群特异性抗原决定簇，具有一定的免疫保护性。在病毒粒子中，VP3同自己以及VP2、VP1、病毒基因组相互作用，在病毒的致病性特别是病毒吸附细胞时具有重要作用，此外VP3还参与病毒的包装，并具有稳定RNA基因组的作用。Wang等研究发现，IBDV VP3羧基端一些氨基酸的改变将影响到病毒的致病性。为了解IBDV分离株中的VP3分子特征，本研究对获得的1株IBDV分离株的VP3进行分子特征分析，并对该蛋白进行原核表达，以期为进一步研究VP3的功能奠定基础，同时分子特征分析也为进一步了解流行株的变化趋势、制定有效的IBD防控措施提供依据[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

IBDV分离株JS7为笔者所在的课题组自行分离保存，大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)、pET-28a表达载体为笔者所在实验室保存，pMD18-T、DL2000 Marker购自大连宝生物有限公司，限制性核酸内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ等购自Fermentas公司，Trizol RNA抽提试剂、2×TaqDNA mix、dNTPs、PCR产物纯化试剂盒等购自上海东洋仿生物科技有限公司；M-MLV逆转录酶和RNase抑制剂购自Promege公司，琼脂糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司，胶回收试剂盒购自天根生物制剂有限公司，其他试剂均为进口或国产分析纯产品。

1.2 引物的设计

利用Primer5.0软件根据已发表的IBDV毒株CEF94的A片段(序列号：AF194429)VP3序列设计1对引物：上游Y1，5′-CCGGATCCCGCTTCAGAGTTCAAAGAGA-3′(BamH Ⅰ)，下游Y2，5′-CCAAGCTTCCTCACTCAAGGTCCTCATC-3′(Hind Ⅲ)，引物由深圳华大基因公司合成。

1.3 JS7-VP3基因的RT-PCR扩增和克隆

将含有JS7毒株的鸡法氏囊组织剪碎研磨后按质量体积比1 g ∶5 mL的比例加入PBS(pH值7.4)，混匀，反复冻融3次， 12 000 r/min 离心3 min，取上清200 μL，加入1 mLTrizol振荡混合均匀，按常规方法[4]提取总RNA。逆转录：取RNA 6 μL，加入随机引物1 μL(25 pmol/μL)，混匀，70 ℃水浴作用10 min，-20 ℃冰浴作用5 min，加入5×RT Buffer 2 μL、dNTPs(2.5 m/moL)0.5 μL，逆转录酶(200 U/μL)0.5 μL，RNase抑制剂0.25 μL(200 U/μL)，总体积20 μL，42 ℃水浴作用1 h后，90 ℃灭活，即得cDNA。RT-PCR(体系)：2×Taqmix 12.5 μL，Y1和Y2引物各1 μL，cDNA模板4 μL，ddH2O 6.5 μL，共25 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶鉴定阳性后回收并直接进行pMD18-T载体克隆，克隆方法按说明书进行，重组载体的鉴定采用蓝白斑、PCR和双酶切法(即BamHⅠ和HindⅢ)进行，阳性克隆命名为pTVP3并送深圳华大基因股份有限公司测序。

1.4 序列分析

用Lasergene的Megalign软件对序列进行同源性比较分析，用MEGA5.0 软件绘制遗传进化树。参考毒株为经典毒株为Cu-1wt、IM、Lukert、CU1M；致弱毒株为Gt、CEF94，疫苗株：B87；超强毒株为OKYM、UK661、HK46、BD3/99、Harbin-1、02015.1、Gx、HLJ-0504、SH95；血清Ⅱ型毒株OH。

1.5 JS7-VP3基因原核表达载体的构建

测序正确的阳性重组体pTVP3直接用于VP3的原核表达载体的构建，即用HindⅢ和BamHⅠ将VP3基因从pTVP3中酶切，回收的VP3与经过同样酶切回收的原核表达载体pET-28a进行连接，转化BL21感受态细菌，重组载体的鉴定通过菌落PCR和双酶切法进行，并命名为pET-VP3。

1.6 JS7-VP3基因的原核表达及产物的Western-Blot分析

将经过鉴定的pET-VP3菌株接种到2×YT培养基中37 ℃ 180 r/min培养过夜，按1 ∶100比例加入过夜培养的上述培养液。于37 ℃摇床，220 r/min，培养4 h左右，使其D600 nm值达0.6，加入终浓度达1.0 mmol/L 的IPTG，于37 ℃摇床中，220 rap/min培养4～5 h，收集菌体，PBS洗涤2次后加入100 μL 2×SDS上样缓冲液，并于100 ℃水浴煮沸 10 min，12 000 r/min离心10 min，上清液通过SDS-PAGE进行蛋白质电泳鉴定。确定表达后，将含有表达产物的SDS-PAGE凝胶按常规方法转印到硝酸纤维素膜上，封闭液作用 1 h。按1 ∶400加入抗IBDV多抗血清，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5次后加入HRP标记兔抗鸡IgG二抗 (1 ∶20 000)孵育1 h。TBST洗膜3次，洗去未结合的二抗。将膜取出放入含DAB显色液的暗盒里，作用10～30 min，使其显色，观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 IBDV JS7-VP3基因的RT-PCR扩增结果

用Trizol法提取JS7的dsRNA，以获得的dsRNA为模板对VP3片段进行RT-PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，所得片段与预期的目的片段大小相符，约为774 bp，结果见图1。

2.2 JS7-VP3基因的测序结果及分子特征

阳性克隆pTVP3经过测序，所获得的VP3基因大小为774 bp，与预期目的片段大小相符。同源性分析中JS7-VP3与Gx株等vvIBDV参考株的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.8%～99.2%和98.8%～100.0%，与致弱毒株的同源性分别为96.1%～96.5%和98.1%～98.4%，与血清2型参考株的同源性也分别达到了86.3%和94.2%。将JS7-VP3的氨基酸序列与所用参考株进行比对，发现JS7-VP3在关键的氨基酸位点上表现为981P、990A、1005A，而致弱毒株参考株在这些位点上表现为981L、990A、1005T，vvIBDV参考株则表现为981P、990V、1005A。

2.3 JS7-VP3基因的遗传进化分析

JS7-VP3与所有参考株VP3基因在遗传进化树中被分成3个大支，JS7与vvIBDV参考株同属于一个大分支，并与HK46亲缘关系最近，而致弱毒株参考株同属于一个分支，血清2型毒株单独属于一个分支，结果见图2。

2.4 JS7-VP3原核表达的构建及其表达结果

将VP3基因从pT-VP3亚克隆入原核表达载体pET-28a，经过菌落PCR鉴定，疑似菌落出现了774 bp目的条带，将该菌落进行液体培养后提取质粒，经HindⅢ和BamHⅠ双酶切，出现了约5.3 kb的载体片段和774 bp的目的片段，表明pET-VP3构建成功(图3)。重组表达载体经过IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测，pET-VP3菌出现1条32 ku左右的特异性蛋白条带，经Western-Blot鉴定，该蛋白条带能与IBDV阳性血清发生特异性反应(图4)，表明克隆的JS7-VP3成功表达。

3 讨论与结论

在IBDV分子流行病学研究中，VP2高变区分子特征分析是主要的研究靶分子[5-6]，然而更多的研究表明，IBDV其他区域也与IBDV的毒力变化有关[7-9]，VP3是其中的一个重要基因。本研究通过对1株IBDV分离株JS7株的VP3基因分子特征分析发现，JS7-VP3基因在关键的氨基酸位点上表现为981P、990A、1005A，在981、1005位点上与vvIBDV有关，而在990位点上则与致弱毒株有关，但在同源性和遗传进化分析中，JS7-VP3则更接近于vvIBDV，笔者所在课题组前期进行的致病性试验[10]也发现，该毒株在商品鸡上的死亡率仅为10%，远低于vvIBDV毒株NN1172引起的死亡率。VP3蛋白上的羧基端981、990、1005位点是目前发现的不同毒株之间有突变的位点，而其羧基端也被认为与病毒的致病性相关。Wang等在分析vvIBDV Gx株和致弱毒株Gt株的基因组时发现，这2个毒株在VP3上的981、990、1005位点有差异，他们的进一步研究发现，将致弱毒株Gt株的990A变成V后，影响了重组病毒在CEF上的复制能力[3]。在王伟的研究中，vvIBDV毒株GX8/99在SPF鸡胚和CEF连续传代后，该毒株也在这3个位点上发生改变，后与弱毒株完全一致，改变后的毒株再连续回鸡后，990位点仍然保持为A不变，1005位为T不变，与弱毒株一致，981位点则发生回复突变[11]。在对JS7的背景进行查询时发现，该毒株分离于免疫鸡群，结合其死亡率低和VP3的分子特征，推测JS7发病鸡群很可能是由活苗污染、生物安全措施不到位、没有采取全进全出等造成疫苗毒在鸡场不断回鸡造成的[10]。在Boot等的研究中，将血清Ⅱ型毒株的VP3基因羧基端取代Ⅰ型的vvIBDV后的重组病毒，其对SPF鸡的毒力大大的减弱[12]。此外，在Jagadish等的研究中，VP3蛋白中与抗原相关的位点位于860～923位氨基酸之间，而笔者通过分析发现，不同毒株以及本分离株在VP3的860～923位点之间同源性均较高，仅仅在羧基端的981、990、1005位点上表现出差异[13-14]。因此，本研究结果也进一步提示，在VP3基因分子特征分析中，尤其是羧基端的分析将在IBDV分子流行病学研究中发挥越来越重要的作用，值得关注。

本试验成功构建了JS7-VP3的原核表达载体pET-VP3，经IPTG诱导后主要以包涵体形式表达，重组蛋白能够和鸡IBDV高免血清发生特异性反应，表明利用pET-28a系统表达的VP3蛋白具有良好的免疫原性。pET系统是常用的一个高效原核表达系统，目的基因受噬菌体T7启动子的强转录及翻译信号控制，在IPTG诱导下，高效表达其下游的外源基因，表达量可高达菌体蛋白的50%[15-17]。张改平等用pET系统对IBDV-VP3进行了表达，结果获得了2种不同分子量且都与IBDV阳性血清发生反应的表达产物，而本研究结果利用该系统则获得了一种表达产物[17-18]，与Deng等的结果[19]一致，单一表达产物更利于对产物进行纯化及相应的特异性抗体研制，为进一步研究IBDV特异性的检测方法的建立以及VP3在IBDV致病性中的进一步研究奠定了基础。

参考文献：

[1]Eterradossi N，Saif Y M. Infectious bursal disease[M]//Swayne D E，Glisson J R，McDougald L R，et al. Diseases of poultry. 13th ed. New Jersey：Wiley-Blackwell，2013：219-246.

[2]von Einem U I，Gorbalenya A E，Schirrmeier H，et al. VP1 of infectious bursal disease virus is an RNA-dependent RNA polymerase[J]. Journal of General Virology，2004，85(8)：2221-2229.

[3]Wang Y，Qi X，Kang Z，et al. A single amino acid in the C-terminus of VP3 protein influences the replication of attenuated infectious bursal disease virusinvitroandinvivo[J]. Antiviral Research，2010，87(2)：223-229.

[4]萨姆布鲁克，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南[M]. 2版. 金冬雁，黎孟枫，译. 北京：科学出版社，1992.

[5]He X，Wei P，Yang X，et al. Molecular epidemiology of infectious bursal disease viruses isolated from Southern China during the years 2000—2010[J]. Virus Genes，2012，45(2)：246-255.

[6]何秀苗，官丁明，韦 平，等. 2000—2007年广西鸡传染性法氏囊病病毒的分子流行病学[J]. 病毒学报，2009，25(5)：437-443.

[7]Boot H J，Hoekman A J，Gielkens A L. The enhanced virulence of very virulent infectious bursal disease virus is partly determined by its B-segment[J]. Archives of Virology，2005，150(1)：137-144.

[8]Boot H J，ter Huurne A A，Hoekman A J，et al. Rescue of very virulent and mosaic infectious bursal disease virus from cloned cDNA：VP2 is not the sole determinant of the very virulent phenotype[J]. Journal of Virology，2000，74(15)：6701-6711.

[9]Escaffre O，le Nouёn C，Amelot M，et al. Both genome segments contribute to the pathogenicity of very virulent infectious bursal disease virus[J]. Journal of Virology，2013，87(5)：2767-2780.

[10]He X，Chen G，Yang L，et al. Role of naturally occurring genome segment reassortment in the pathogenicity of IBDV field isolates in Three-Yellow chickens[J]. Avian Pathology，2016，45(2)：178-186.

[11]王 伟. IBDV超强毒株GX8/99株VP3基因及其A节段3′端非编码区基因与致病性的关系[D]. 泰安：山东农业大学，2007.

[12]Boot H J，ter Huurne A A，Hoekman A J，et al. Exchange of the C-terminal part of VP3 from very virulent infectious bursal disease virus results in an attenuated virus with a unique antigenic structure[J]. Journal of Virology，2002，76(20)：10346-10355.

[13]Jagadish M N，Azad A A. Localization of a VP3 epitope of infectious bursal disease virus[J]. Virology，1991，184(2)：805-807.

[14]Mahardika G N，Becht H. Mapping of cross-reacting and serotype-specific epitopes on the VP3 structural protein of the infectious bursal disease virus (IBDV)[J]. Archives of Virology，1995，140(4)：765-774.

[15]Studier F W，Moffatt B A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes[J]. Journal of Molecular Biology，1986，189(1)：113-130.

[16]Studier F W，Rosenberg A H，Dunn J J，et al. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes[J]. Methods in Enzymology，1990，185：60-89.

[17]张改平，席 俊，王选年，等. IBDV VP3结构蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定[J]. 河南农业科学，2005(8)：88-91.

[18]赵 坤，郑玉姝，赵德明，等. 鸡传染性法氏囊病病毒VP3 蛋白的原核表达及其B细胞抗原表位鉴定[J]. 中国预防兽医学报，2009，31(12)：958-962.

[19]Deng X，Gao Y，Gao H，et al. Antigenic structure analysis of VP3 of infectious bursal disease virus[J]. Virus Research，2007，129(1)：35-42.