五倍子物的提取及其对弧菌抑制作用的初步研究

朱珍珍 李青霞 邓嘉仪 郑梓唯 赵鋆伟 唐建洲

（长沙学院 生物与环境工程学院，湖南长沙 410022）

南美白对虾自从引进以来就深受广大对虾养殖业者的喜爱，养殖规模就迅速扩大，短短几年时间就发展成我国养殖面积最广的对虾。然而，近年来随着养殖规模的不断扩大和放养密度的增加，由细菌和病毒性疾病引发的病害也日趋严重，给养殖者造成了严重的经济损失，已成为当前限制凡纳滨对虾养殖业持续发展的瓶颈问题。我国具有丰富的植物资源，应用植物药来防治水产动物疾病有着悠久的历史[1]。植物药具有天然、环保、无药物残留、对病原微生物不易产生抗药性、毒副作用较小等优点，也能提高水产动物的抗应激能力，因此植物药的开发和利用受到国内外学者的广泛关注，对饲料工业、水产养殖业以及环境保护与人类健康都具有重大的现实意义。

五倍子为蚜科昆虫角倍蚜或倍蛋蚜在其寄主盐肤木、青麸杨或红麸杨等树上形成的虫瘿，异名文蛤、百虫仓、木附子等。研究表明，五倍子具有很强的抗菌作用，主要药效成分单宁酸（Tannin Acid），又称丹宁、鞣酸或鞣质。植物单宁酸具有天然、高效等优点，具有广阔的开发前景和应用价值。临床研究表明五倍子佐以庆大霉素、甲硝哇能增强杀菌效果，特别对铜绿假单抱菌、厌氧菌的作用尤为显著，五倍子对羊毛样抱子菌等真菌也有较强的抑制作用[2]。

本文对传统的盐酸提取法进行了优化，并研究了五倍子提取物对弧菌的抑制作用，为南美白对虾健康养殖和可持续发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 五倍子

本实验所采用的五倍子为药店购买。

1.1.2 弧菌

本实验室保存的弧菌有副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和创伤弧菌ATCC27562。

1.1.3 培养基

培养基主要为2216E液体培养基、2216E固体培养基，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。2216E 半固体培养基配置方法：按照质量比 1：1 的比例称分别取 2216E 固体培养基与 2216E液体培养基，后加入适量蒸馏水备用[3]。

1.2 实验方法

1.2.1 五倍子提取物的制备

采用超声波法优化传统提取工艺提取五倍子有效成分，并采用液相色谱的方法分析提取物的浓度和纯度。

1.2.2 单因子实验设计

以溶剂浓度、溶剂倍量、超声波时间和超声波频率为单因子水平开展提取实验[4]（表1）。

表1 超声波提取单因子参数

1.2.3 正交实验设计

在单因子实验的基础上，本试验采用正交表，对五倍子没食子酸提取率影响最大的四个因素盐酸浓度、溶剂倍量、超声波时间和超声波频率4个因素，选择3个水平进行优选。超声方法为间歇超声，即每超声3秒，间歇3秒（见表2）。

表2 正交实验设计表

1.2.4 实验菌株的活化

实验室保存的副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和创伤弧菌ATCC27562三种弧菌冻干粉，进行活化处理，分别接种于2216E液体培养基中，温度28℃、转速180r/min的摇床上培养，备用。

1.2.5 体外弧菌抑制实验

试验不同浓度五倍子提取物对副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和创伤弧菌ATCC27562的抑制作用，设计五倍子提取物的浓度梯度0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 g/ml，研究五倍子提取物的体外抑制弧菌效果，获得抑制弧菌生长与繁殖的最佳五倍子提取物浓度[5-6]。

2 结果与分析

2.1 五倍子提取物含量分析

五倍子提取物标准物进样量为10μl，保留时间为4.851min，峰面积为3226273。

2.2 单因子实验对五倍子提取物的提取量的影响

2.2.1 盐酸浓度对五倍子提取物提取量的影响

用不同倍量的盐酸水解五倍子粉末后所检测出的峰面积是不同的，但是当变量是溶剂倍量时，峰面积的大小不能代表没食子酸的含量。但是，根据标准样品测出的浓度与峰面积的关系。就可以通过不同倍量峰面积大小求出相应的没食子酸浓度，再用浓度乘以相应水解倍数（10倍、20倍、30倍、40倍、50倍）便能得到没食子酸含量。在盐酸浓度、溶剂倍量、超声波时间和超声波频率一定的条件下，当盐酸浓度为1mol/L时，其液相色谱峰面积最大，能提取出五倍子有效成分的含量最多，此为最佳浓度。

2.2.2 溶解倍数对五倍子提取物提取量的影响

五倍子粉末在酸性溶液（HCl）中水解后，其中的主要成分—鞣质被水解成没食子酸，然后将其置于超声波仪器中提取，最后用高效液相色谱法（HCLP）检测其中的没食子酸含量。在盐酸浓度为6M时，进料量为10μl，当溶解倍数为20倍时，五倍子提取物的液相色谱图的峰面积值最大，所以由此得出提取五倍子提取物的最佳溶解倍数为20倍。

2.2.3 超声波时间对五倍子提取物提取量的影响

没食子酸的含量测定采用HPLC法。具体方法为：五倍子粉末在酸性溶液（HCl）中水解后，其中的主要成分—鞣质被水解成没食子酸，然后将其置于超声波仪器中提取，将提取液在12000rpm、5min条件下离心后，进样。在进料量为10μl，盐酸浓度为6M，提取五倍子提取物的超声波时间是5min时，峰面积最大，则此时间为最佳提取时间。

2.2.4 超声波时频率对五倍子提取物提取量的影响

当变量是超声波提取功率时，峰面积的大小正是代表了所提取出的没食子酸的含量。由图5可知，超声波功率在40～200W范围之间时，峰面积大小变化是没有准确的规律可循的，但是超声波功率调整到200W之后，峰面积与超声波功率呈正比关系，而后，峰面积大小与超声波功率呈负相关。在其他条件不变、超声波提取功率在240W时，其液相色谱峰面积最大。所以提取五倍子主要物质—鞣质时，最佳的超声波提取功率为240W。

2.3 正交优化实验下五倍子提取物的最佳提取条件

最佳的提取五倍子提取物的条件是1mol/L HCl、溶解倍数为20倍、超声波20min 和频率240W。

2.4 不同浓度的盐酸提取的五倍子提取物抑菌效果

在一定的条件下，五倍子提取物浓度的越高，其对副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌等弧菌的抑制作用也越大，且随着五倍子提取物的浓度的提高，其对弧菌的抑制效果增大，呈线性关系。

3 讨论

本实验对五倍子提取物的提取率进行了系统的研究，五倍子天然抗菌物质的提取采用超声辅助酸提取法，结果表明，盐酸浓度、溶剂倍量、超声波时间和超声波频率对五倍子提取物的提取量均有影响。最佳提取工艺条件为：1mol/L HCl、溶剂的溶解倍数为20倍、超声波提取时间为20min 和频率240W。

五倍子是一种天然的植物抑菌物质，我们采用盐酸溶解五倍子粉末，通过用探究到的最佳提取工艺条件，得到五倍子提取物，并考察了该提取物对供试的3种病原菌的抑菌效果，发现五倍子盐酸提取物中的抑菌成分对供试的三种菌均有明显的抑菌作用，最小的抑菌浓度分别为：副溶血弧菌0.0625 g/ml，创伤弧菌0.03125 g/ml，溶藻弧菌0.03125 g/ml。通过实验探究的抑菌效果，证明，在1mol/L HCl、溶剂的溶解倍数为20倍、超声波提取时间为20min 和频率240W的提取工艺条件下、在0-1g/ml 五倍子提取物的范围内，1 g/ml五倍子酸提取物对副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的抑菌效果均为最佳。

本文初步考察了五倍子盐酸提取物的提取工艺及其抑菌效果，而对于提取五倍子有效成分的最佳溶解剂（如水、醇等）还未得到确认，因此，下一步工作将对提取五倍子有效成分的溶解剂进行实验探究，并对比出最佳溶解剂，以期五倍子提取物能够发挥更好的抑菌效果。

[1] 宋靖芳.中草药对鱼类病原气单胞菌、弧菌的体外抑制作用研究[D].华南师范大学，2004.

[2] 邱庆连，潘清清，张友平，等.五倍子、乌梅等45种中草药提取物对锯缘青蟹致病弧菌的抑菌作用研究[J].浙江海洋学院学报（自然科学版），2010，（1）：34-38.

[3] 彭勇. 副溶血噬菌体的分离鉴定、裂解性能及其在副溶血弧菌的快速检测中的初步应用[D].中国海洋大学，2013.

[4] 李红然，付大友，李艳清，等.超声微波协同萃取-HPLC测定五倍子中的没食子酸含量[J].化工时刊，2011，（1）：36-38，41.

[5] 金周浩.副溶血弧菌的分子检测与基因分型研究[D].浙江工商大学，2008.

[6] 罗词兴，黄旭雄，李桑，等.溶藻弧菌感染后凡纳滨对虾鳃组织免疫相关基因的表达[J].中国水产科学，2014，（1）：189-196.