广西龟鳖致病菌及其药敏特性调查

覃俊奇，韦信贤，黎小正，吴祥庆，兰宗宝，杨慧赞，黄国秋，黄鸾玉，陈 静，童桂香*

(1.广西水产科学研究院，广西南宁530021;2.广西农业科学院农业科技信息研究所，广西南宁530007)

龟鳖产业是广西渔业的特色产业和新兴产业，是农民增收致富的重要途径，主要养殖品种有广西拟水龟、安布闭壳龟、缅甸陆龟、黄沙鳖、山瑞鳖等［1］。根据《广西龟鳖资源调查》项目的统计，2013年广西全区规模养殖户达9.83万户，产量2.82万t，全国排名第8位;产值78亿元，全国排名第7位［2-3］。近几年，随着人们对龟鳖宠养和药膳保健需求的不断增加，龟鳖市场交易相当活跃，产品价格也持续居高，龟鳖养殖效益喜人，致使广西龟鳖养殖队伍仍在不断壮大。然而，在高效经济利益的驱使下，养殖户过于注重龟鳖的生长速度而忽视了对养殖环境的保护及各类疾病的防治，加上多数养殖户没有水产动物养殖的相关知识，导致龟鳖疾病如白眼病、肺炎、红底板病等细菌性疾病在龟鳖养殖中常有发生［4-6］;养殖户在龟鳖发病初期因救龟鳖心切，常不经确诊和药敏试验就盲目地按经验使用抗菌药进行治疗，效果多不理想，往往会造成极大的经济损失。为了解引起广西龟鳖细菌性疾病的病原菌种类及其药敏特性，对2015—2016年来自广西各地的龟鳖病例进行病原菌的分离与纯化，并采用全自动微生物鉴定系统结合16S rDNA测序进行各病原菌的鉴定，同时采用纸片扩散法测定各病原菌对头孢曲松、链霉素、土霉素、强力霉素、恩诺沙星等常用抗菌药的敏感性，旨在为龟鳖养殖生产中细菌性疾病的防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 样品来源

2015—2016年来自广西南宁市、来宾市、钦州市等地共63例龟鳖病例，包括广西拟水龟(石龟)、安布闭壳龟、缅甸陆龟、中华草龟、鳄龟、黄沙鳖、山瑞鳖和珍珠鳖共8个品种。

1.2 主要试剂与仪器

血平板、革兰氏染色液、药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司;脑心浸液琼脂(BHIA)、营养肉汤、LB肉汤、LB琼脂等培养基购自北京陆桥技术有限责任公司;细菌DNA提取试剂盒、PCR反应预混液 2×Taq PCR Master Mix(含 Taq酶、dNTPs、MgCl2等)、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京艾德莱生物有限公司;pMD18－T载体、DH5α感受态细胞、氨苄青霉素购自大连宝生物工程有限公司;细菌16S rDNA的PCR引物是William等［7］报道的通用引物 fD1(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和rP2(5'－ACGGCTACCTTGTTACGACTT－3')，由宝生物工程(大连)有限公司合成。BIOLOG自动微生物鉴定系统(包括浊度仪、细菌培养板、琼脂培养基、接种液、接种棒、棉签、V形加样槽等)为美国BIOLOG公司产品。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离与纯化 用75%的乙醇消毒患病龟鳖体表，无菌条件下从腐皮、肝、肺、肾等取样划线接种于血平板或BHIA平板，置30℃恒温培养16～24 h;选取优势菌落进一步纯化培养、涂片、革兰氏染色、镜检，观察菌落形态特征、细菌的形态和染色特征。

1.3.2 细菌的保种与复苏 挑取纯化培养的单个菌落接种到营养肉汤培养基，于30℃恒温培养16～24 h，加20%甘油分装后于－80℃保种。复苏时将保存的菌种置于冰上15 min，用接种环无菌挑取冻存管内的少量菌液在血平板上划线培养16～24 h。

1.3.3 细菌BIOLOG微生物鉴定系统鉴定 参照童桂香等［8］的方法进行，具体操作如下:将细菌纯培养后进行革兰氏染色及氧化酶试验，以选择合适的培养基和细菌培养板;取纯化培养的单菌落划“十”字接种于琼脂培养基平板培养16～24 h;用接种棒挑取“十”字四边外半部分的菌落，在灭菌的试管内将菌落均匀分散;吸取3～5 mL接种液将试管内分散好的菌落洗下并混合均匀，制备细菌悬浊液;用浊度仪将细菌悬浊液调至合适的浊度，静置5 min后倾入V形加样槽，保留最后的1 mL菌悬液在试管中;在细菌培养板中每孔加入150 μL菌悬液，置于湿盒中在最适温度培养16～24 h;取出细菌培养板，观察结果并运用Biolog Microlog 24.2软件分析，鉴定细菌种属。

1.3.4 细菌16S rDNA鉴定 将纯化培养的细菌接种于营养肉汤培养基中振荡培养16～24 h，离心收集细菌，用细菌DNA提取试剂盒按说明书操作提取总DNA。在PCR反应管中分别加入2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物 fD1、rP2(50 μmol/L) 各1 μL，细菌 DNA 2 μL，加灭菌 DEPC 水至 50 μL;短暂离心后置于PCR仪中进行扩增:95℃预变性5 min，94 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s进行 35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经电泳用凝胶回收试剂盒回收纯化，取纯化的PCR产物与pMD18－T载体连接，转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定;将阳性克隆送大连宝生物工程有限公司测序，所得序列在GenBank数据库中进行BLAST检索比较分析。

1.3.5 药敏试验 采用K－B纸片扩散法进行分离菌株对氨苄青霉素、头孢唑林、头孢拉定、头孢吡肟、头孢曲松、头孢哌酮、红霉素、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、庆大霉素、土霉素、强力霉素、四环素、米诺环素、氯霉素、复方新诺明、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、林可霉素、多黏菌素B、磷霉素、万古霉素、特治星、特美汀和舒普深共27种常用抗菌药物的敏感性试验，并参照CLSI抗菌药物敏感性试验执行标准［9］判定各菌株对供检药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 广西龟鳖病例致病菌检测结果

63例龟鳖病例经细菌分离，从其中的38例样品中分离到48株病原菌，7例病例分离到2种或以上的病原菌，25例没有分离到细菌，细菌检出率为60.3%(38/63);48株病原菌经BIOLOG自动微生物鉴定系统或16S rDNA扩增、克隆(图1)及测序鉴定，其中包括嗜水气单胞菌10株、肺炎克雷伯菌8株、变形杆菌7株、温和气单胞菌4株、弗氏柠檬酸杆菌3株、阴沟肠杆菌3株、摩氏摩根菌3株、大肠杆菌3株、迟缓爱德华菌2株、塞氏柠檬酸杆菌2株、简达气单胞菌2株和栖木槿假单胞菌1株(表1);部分菌株16S rDNA序列已上传至GenBank数据库:嗜水气单胞菌(KP091884)、肺炎克雷伯菌(KP091885、KP091888)、弗氏柠檬酸杆菌(KP091886)、迟缓爱德华菌(KP091887)。

图1 分离菌16S rDNA及其重组质粒pMD18－T－16S rDNA的PCR扩增结果

表1 广西龟鳖疾病细菌性病原调查结果

2.2 广西龟鳖病原菌药敏试验结果

采用K－B纸片扩散法测定了分离的48株病原菌对氨苄青霉素、庆大霉素、四环素、复方新诺明和恩诺沙星等27种抗菌药的药敏特性，结果见表2。各病原菌表现出不同的耐药谱，但均存在多重耐药性;其中对特治星的敏感率最高，达58.3%，其次是头孢曲松和米诺环素，均为52.1%，最低的是多黏菌素 B，为 6.3%;对四环素的耐药率最高，达85.4%，其次是多黏菌素B，为70.8%，最低的是头孢曲松，为14.6%(表 2)。

表2 广西龟鳖病原菌药敏试验结果

续表2 广西龟鳖病原菌药敏试验结果

3 结论与讨论

对2015—2016年来自广西南宁市、来宾市、钦州市等地共63例龟鳖病例进行了细菌性病原检测，从其中的38例样品中分离到包括嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌、温和气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、摩氏摩根菌、大肠杆菌、迟缓爱德华菌、塞氏柠檬酸杆菌、简达气单胞菌和栖木槿假单胞菌共12种48株病原菌，7例病例分离到2种或以上的病原菌，细菌检出率为60.3%;其中，嗜水气单胞 菌［6，10-14］、肺 炎 克 雷 伯 菌［5］、温 和 气 单 胞菌［10，15-17］、摩氏摩根菌［18］和塞氏柠檬酸杆菌［19］已从广西养殖的龟鳖中分离到，但变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、迟缓爱德华菌、简达气单胞菌和栖木槿假单胞菌分离自广西养殖的龟鳖为首次报道。此外，黎小正等［20］从广西某养龟场的黄喉拟水龟中分离到松鼠葡萄球菌，罗华平等［21］从广西某养鳖场的黄沙鳖幼鳖中分离到类志贺邻单胞菌;而未见从广西养殖的龟鳖中分离到病毒的文献，也未见有寄生虫引起龟鳖大量死亡的报道。说明广西龟鳖疾病仍以细菌性疾病为主，且病原复杂、存在混合感染;病原菌多为条件性致病菌，以嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯菌和变形杆菌为主。因此，龟鳖养殖过程中应遵循各种龟鳖的生长特征及习性，不断提高繁殖养殖技术，避免近亲繁殖，做好种质资源保护，坚决杜绝“拔苗助长”式养殖;同时，不断加强养殖环境的保护和提高预防病害的意识，大力推广仿生态健康养殖观念及养殖技术，减少各种疾病的发生。

目前，使用各种抗菌素类药物抑制或者杀灭致病菌仍是防治细菌性疾病最有效的手段。抗菌药对龟鳖细菌性传染病的治疗和控制起到了非常重要的作用［22］，但养殖过程中不科学地使用抗菌药，极易造成致病菌产生耐药性。本研究进行了48株龟鳖病原菌对27种抗菌药的药敏试验，结果表明，各病原菌都存在严重的多重耐药性，对四环素的耐药率最高(85.4%)，其次是多黏菌素 B(70.8%)，最低的是头孢曲松(14.6%)。有文献报道，分离自广西养殖龟鳖的嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯菌、温和气单胞菌、摩氏摩根菌和塞氏柠檬酸杆菌也均存在多重耐药性［5，12-21］，说明广西龟鳖源细菌对抗菌药已经产生了广泛的耐药性。经调研发现，龟鳖养殖过程中滥用抗菌药现象确实非常普遍，如将抗菌药作为预防药物长期使用、龟鳖发生疾病时凭经验使用多种抗菌药物进行治疗、为了快速见效常加大用药剂量或缩短用药间隔等，这些盲目使用抗菌药的效果多不理想，不但造成药物浪费，而且延误病情，给养殖户造成很大的经济损失;还会导致耐药菌株不断出现及耐药性不断增强、产品药物残留超标和环境污染等问题，对龟鳖养殖业的可持续健康发展构成严重威胁，甚至威胁人类公共卫生安全。此外，药敏试验结果显示，多数龟鳖分离菌对一些禁用药如红霉素、氯霉素、氧氟沙星、诺氟沙星及人用药特治星、特美汀和舒普深也存在部分或严重的耐药性，提示在广西龟鳖养殖生产过程中有可能使用过这些药物，应引起相关监管部门的重视并采取措施介入监管。因此，在龟鳖养殖生产过程中应推行“防病不用抗菌药，治病慎用抗菌药”的原则，即在预防疾病时以使用中草药、免疫增强剂、微生态制剂等增强龟鳖体质和改善养殖环境为主，治病时应及时送实验室诊断并根据药敏试验尽早选取敏感药物以适当剂量给药治疗，做到科学、合理用药，减少多重耐药菌株的产生，避免给人和动物带来的危害。

本研究表明，广西龟鳖疾病仍以细菌性疾病为主，且病原复杂、存在混合感染，其中以嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯菌和变形杆菌为主;48株分离自广西发病龟鳖样品的病原菌具有不同的敏感药物谱和耐药谱，均表现出多重耐药性。

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