不同产地库尔勒香梨萼端黑斑病病原菌的分离鉴定

吴玉鹏，赵晓梅

(1.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831100；2.新疆农业科学院生物质能源研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】库尔勒香梨是最具新疆特色的地方果品之一[1]，巴音郭楞蒙古自治州(以下简称“巴州”)和阿克苏地区是库尔勒香梨的主要产地。据统计，2016年巴州地区库尔勒香梨种植面积4.017×104hm2(60.26万亩)，产量42.83×104t，而同年阿克苏地区库尔勒香梨种植面积1.16×104hm2(17.45万亩)，产量35.03×104t。两产地库尔勒香梨种植面积和产量出入很大，主要因为近几年巴州地区冻害发生程度较重，对树体造成了严重的影响，果品产量大幅度下降。库尔勒香梨萼端黑斑病是近几年发现的一种贮期病害，2013年库尔勒香梨萼端黑斑病呈蔓延加重趋势，轮台园艺场大多梨园普遍发生，轻重不一，重者发病果率达30%[2]，损失严重，研究库尔勒香梨萼端黑斑病的控制技术势在必行。【前人研究进展】早期对苹果梨的侵染过程及其预先合成抗菌物质的诱导研究认为6% CaCl2、l% 壳聚糖、45℃ 20 min和50℃ 10 min热水处理均能有效地控制苹果梨的黑斑病[3]。近10年来，由于萼端黑斑病对库尔勒香梨的影响较大，有研究认为库尔勒香梨萼端黑斑病是一种由于果实品质下降和N/Ca、K/Ca失调及缺钙引起的生理性病害[4]，也有库尔勒香梨萼端黑斑病病原菌是链格孢属交链孢菌(Alternariaalternate(Fr.)Keissl)的报道[5-6]。【本研究切入点】采前喷钙[7]、采后浸钙[8]、采后1-MCP处理[9]以及采前喷钙、采后1-MCP和MAP相结合[10]的处理等能较为有效地控制库尔勒香梨萼端黑斑病的发生，并能保持果实的营养成分，增加其商品性，但目前对库尔勒香梨两大主产区巴州和阿克苏地区萼端黑斑病病原菌生物学特性方面的研究还未见报道。以两价目产地库尔勒香梨萼端黑斑病果为研究对象，研究两个产地萼端黑斑病的疾病种类。【拟解决的关键问题】调查统计两大主产区库尔勒香梨萼端黑斑病的发病情况，确定不同产区库尔勒香梨萼端黑斑病致病菌种类，对优势或主导病原菌菌群进行形态学及分子生物学鉴定，研究其病原菌的生物学特性，为库尔勒香梨萼端黑斑病的防治提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

从巴州和阿克苏两个主产区的果品冷库采集到的库尔勒香梨萼端黑斑病病果。

1.1.2 试剂

PDA培养基、95%乙醇、75%乙醇、无水乙醇、10 mg/mL Rnase(Sigma)、异丙醇、10% SDS、1X TE(pH 8.0)、经 Millipore 过滤灭菌纯化水。

1.1.3 设备

FA2004 型分析天平：上海蒲春计量仪器有限公司；DL-1型万用电炉：北京永光明医疗仪器厂；C-C phase turret condenser型尼康显微镜：日本；SW-CJ-DF型洁净工作台：上海博讯实业有限公司；BPH-9042型电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；LDZX-75KB型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；Eppendorf 5417R型离心机：德国；Millipore型纯水仪：美国；DYY-7B型电泳仪：北京六一仪器厂。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分离、纯化

取两地萼端黑斑病病果各2个，先后用清水、70%的酒精、无菌水冲洗果实表面，镊取病健交界处果肉5 mm，在25℃ PDA培养基中培养48～72 h，观察菌落生长情况。从PDA培养基菌落边缘挑取适量菌丝转移到新的PDA培养基上，相同条件下纯化培养。在培养的过程中观察是否有其他杂菌生长，反复培养多次直到分离出形态一致的菌株。将纯化的菌株反接于健康果以确定致病性。

1.2.2 病原菌的确定

参照许玲等略改[11-13]，用75%酒精、无菌水冲洗果实，用无菌接种针刺3个大小深度一致的孔，再用含0.01% Tween-80的0.85%无菌生理盐水配制孢子悬浮液，调节至1×106个孢子/mL。用移液枪移取30 μL孢子悬浮液注入伤口，每一菌株处理10个果实，以0.85%无菌生理盐水作对照。以25℃ 90%～95%RH培养3～5 d。若发病症状与最初果实症状一致，则确定该菌株为萼端黑斑病致病菌。

1.2.3 病原菌的鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定

划线培养：用无菌接种针沾取少量致病孢子，在PDA培养基上采用平板划线法培养菌丝。倒置于25℃培养箱中培养，并观察记录。

载玻片培养法参照方中达[14]。

1.2.3.2 病原菌的分子鉴定

① 基因组 DNA 提取 ：在无菌状态下取一定量菌株，加入液氮研磨；研磨好后放入1.5 mL离心管中，做好标记，加入0.6 mL TE(pH 8.0)，混合均匀，使菌液充分悬浮；加入250 μL 10% SDS，轻轻倒转混匀；加入 3 μL蛋白酶 K(20 ng/μL)，轻轻混匀， 37℃水浴 1 h；加入 150 μL 5 mol/L NaCl，轻轻混匀；加入 150 μL 2% CTAB，轻轻混匀，65℃水浴 20 min； 12 000 r/m 常温离心 20 min；吸取上清液至1.5 mL离心管，加入等体积异丙醇，充分混匀，在室温下放置 30 min，4℃ 条件转速12 000 r/m离心 10 min；去除上清液，加 入750 μL 70%乙醇，充分混匀，在4℃ 下转速12 000 r/m离心 2 min；加入 30 μL 10 ng/μL Rnase纯化水溶解沉淀，混匀后，4℃过夜。

② DNA 电泳检测。

③ PCR 扩增：18s引物序列： ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’； ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 反应体系：H2O 17.8 μL、Buffer 3 μL、d NTP 2 μL、Primer1 3 μL、Primer2 3 μL、DNA 模板 1 μL、酶 0.2 μL、总体积 30 μL；反应条件： 95℃ 5 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min、35 cycle；72℃ 10 min；12℃ forever；

④ 电泳 PCR 产物鉴定。

⑤ 上机测序，输出峰图。

北京六合华大基因科技有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 库尔勒香梨萼端黑斑病的发病症状

萼端黑斑病病原菌可在冬季潜伏，次年发病，库尔勒香梨在生长后期即可发病，采后贮藏期发病更为严重。发病症状为：发病初期，萼部果皮出现黑褐色斑块，随之硬化，病斑面积增大，无汁液产生，病斑最后呈现黑褐色凹陷。图1

2.2 病原菌的形态学鉴定

经过划线培养后，菌种的生长状态。图2

挑取少量产孢菌丝体，置于无菌水载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察菌体形态特征，观察并记录。显微镜下菌体具有明显的分生孢子，褐色，卵圆形，3 d培养后菌落直径可达100～120 mm。

显微镜下菌体具有明显的分生孢子，褐色，卵圆形，3 d培养后菌落直径可达100～120 mm。图3

图1 不同产地库尔勒香梨萼端黑斑病病果
Fig.1 The Korla pear Calyx end black spot disease fruits in different regions

图2 菌种生长状态
Fig.2 The growth state of the fungus

图3 显微镜下菌体形态特征
Fig.3 The morphological characteristics of the bacteria under the microscope

2.3 病原菌的rDNA-ITS分子标记法鉴定

2.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物

研究表明，电泳条件：3 μL样品+1%琼脂糖凝胶，Marker 条带组成：100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp。750 bp 条带浓度为 60 ng/3 μL，显示为加亮带，其余条带浓度均为 30 ng/3 μL。电泳方向从上向下。 图4

图4 病原菌PCR扩增产物电泳图
Fig.4 Electrophoresis of pathogenic bacteria PCR

2.3.2 病原菌rDNA-ITS片段序列

测序结果：

阿克苏产区库尔勒香梨萼端黑斑病病原菌rDNA-ITS片段序列：

ACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGC CTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAG CATATCAAAAGCCCGGAGGAA

巴州产区库尔勒香梨萼端黑斑病病原菌rDNA-ITS片段序列：

CCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA

2.3.3 blast 结果

① 阿克苏产区的库尔勒香梨萼端黑斑病病原菌与Alternaria alternata 的亲缘关系最近。

② 巴州产区的库尔勒香梨萼端黑斑病病原菌与 Alternaria alternata 的亲缘关系最近。

分析比对阿克苏地区和巴州地区库尔勒香梨萼端黑斑病病原菌的rDNA-ITS序列，结果表明，以分离纯化的病原菌DNA为模板，用真菌18s 引物进行扩增，获得的片段长度分别为573和562 bp，通过blast 结果表明，阿克苏地区和巴州地区库尔勒香梨萼端黑斑病病原菌与Alternariaalternata菌亲缘关系最近，因而确认两个主产区的库尔勒香梨萼端黑斑病病原菌属于同一菌属。

3 讨 论

Simmons等把产孢表型做为区分小孢子链格孢种的关键点[15]，而Peever等发现小孢子链格孢在形态上相近，建议将链格孢命名为 Aalternata 的不同致病型[16]。孙霞等[17]从对Alternaria小孢子种的亲缘关系远近看出，种的形态差异小，序列差异也小，亲缘关系就越近。

通过对形态学和26S rDNA D1/D2序列的对比，能正确划分链格孢属之间的小孢子种，之前的学者鉴定这种致病菌为链格孢属交链孢菌Alternariaalternate(Fr.)Keissl。形态学和比较形态学鉴定 rDNA-ITS序列，能客观、迅速、便捷地鉴定真菌[18]。

贾晓辉等[4]从库尔勒香梨萼端黑斑病病健交界处果肉分离提取得到枝孢霉属和链格孢属，回接或混接至健康果后，没有产生已知的发病症状。唐文娟通过对香梨黑头病病原菌的致病性试验、形态学特征及rDNA-ITS分子标记的鉴定，认为黑头病病原菌是真菌界半知菌亚门丝孢纲丝孢目暗色孢科枝孢属多主枝孢菌[19]。上述两者研究的结果与试验的结果不一致[6]。

4 结 论

从巴州和阿克苏两个主产区的果品冷库采集到的库尔勒香梨萼端黑斑病病果上分离纯化出相同菌落生长形态一致的若干菌株，确定该菌是导致果实分别发病的病原菌。显微镜下菌体都具有明显的分生孢子，褐色，卵圆形，3 d培养后菌落直径可达100～120 mm。通过病原菌的r DNA-ITS分子标记法鉴定，分析比对两个病原菌的rDNA-ITS序列，以分离纯化的病原菌DNA为模板，用真菌18s引物进行扩增，获得的片段长度分别为573和562 bp，通过blast 结果表明，两个病原菌与Alternariaalternata菌亲缘关系最近。巴州产区和阿克苏产区库尔勒香梨萼端黑斑病的致病菌都是单一致病菌，并且形态学一致，属于同一菌属，最后鉴定萼端黑斑病致病菌为链格孢属交链孢菌(Alternariaalternate(Fr.)Keissl)。

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