硫化氢对糖尿病大鼠肾脏纤维化的影响及其机制*

贾 强， 王 蕾， 王其一， 刘小粉， 马善峰， 杨 锐

(蚌埠医学院生理学教研室， 安徽 蚌埠 233030)

糖尿病肾病是糖尿病严重的慢性并发症之一，其由糖尿病微血管病变引起，最终导致慢性肾功能衰竭[1]。肾脏纤维化是糖尿病肾病重要的病理改变之一。肾脏纤维化的特征主要表现在肌成纤维细胞数量增加，炎性细胞浸润、聚集，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分如胶原蛋白和纤维连接蛋白等过度积聚[2, 3]。研究发现，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smad3信号通路在肾脏纤维化中起重要作用[4]。

硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是体内发现的第3种气体信号分子[5]。内源性H2S主要由胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)分解L-半胱氨酸产生。CBS主要存在于神经系统；CSE则主要存在于心血管系统，且容易被炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PAG)阻断[6]。大量研究表明，H2S对神经系统、心血管系统、呼吸系统和视觉系统等均发挥重要的生理调节功能[7-9]。最近的研究发现CSE/H2S与肾脏纤维化密切相关[10]，但其具体作用机制尚不清楚。因此，本研究通过建立1型糖尿病大鼠肾损伤模型，分别给予H2S的外源性供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide，NaHS)和CSE的阻断剂PAG干预，观察H2S对糖尿病大鼠肾脏纤维化的影响并探讨其分子作用机制，旨在为H2S在临床上治疗糖尿病肾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性SD大鼠(32只)由蚌埠医学院实验动物中心提供，体质量(180±20) g。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、NaHS和PAG购自Sigma公司；血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)和羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；大鼠白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素6 (interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技公司；兔抗大鼠Smad3和磷酸化Smad3(phosphorylated-Smad3，p-Smad3)一抗抗体购自Cell Signaling Technology公司；兔抗大鼠转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗抗体购自Abcam公司；兔抗大鼠IV型胶原(collagen-IV，col-IV)一抗抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗抗体购自武汉博士德公司。

1.2 动物分组及模型建立

大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照(NC)组、糖尿病对照(DC)组、糖尿病+NaHS(DM+NaHS)组和糖尿病+PAG(DM+PAG)组(n=8)。大鼠禁食12 h后，NC组腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液，其余3组大鼠均一次性腹腔注射55 mg/kg STZ。3 d后，大鼠禁食后测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，取FBG≥16.7 mmol/L为1型糖尿病大鼠。造模成功后，所有大鼠自由饮食、饮水。第5周起，NC组和DC组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，DM+NaHS组和DM+PAG组大鼠分别腹腔注射56 μmol/kg NaHS和40 mg/kg PAG[6]，每天1次，共干预4周。

1.3 检测FBG、BUN和SCr水平

第8周末，大鼠腹腔注射4%水合氯醛(10 ml/kg)诱导麻醉，测FBG值。腹主动脉采血取血清，利用试剂盒检测血清中BUN和SCr水平。

1.4 Masson染色观察肾胶原纤维沉积

取大鼠新鲜肾脏，浸于10%福尔马林中固定，脱水、包埋、切片，Masson染色后观察胶原纤维变化。应用Image-Pro Plus 6.0软件，每张切片随机选取5个不同视野，测定胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)，CVF=胶原面积/总面积，取平均值。

1.5 电镜观察肾皮质超微结构变化

取大鼠新鲜肾组织，切割成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，浸入4℃、2.5%戊二醛溶液中固定，脱水包埋、制备超薄切片。经醋酸铀、柠檬酸铅染色后，透射电镜观察肾皮质超微结构变化。

1.6 肾组织IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平检测

取大鼠肾脏，冰上制备组织匀浆，分别按照试剂盒说明书操作，检测IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平。

1.7 Western blot检测肾脏组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3和col-IV蛋白水平

提大鼠肾脏组织蛋白，测蛋白浓度。蛋白经SDS-PAGE分离后，转印至PVDF膜上。室温封闭2 h，再分别加入1∶1 000稀释的TGF-β1、Smad3和p-Smad3一抗抗体，1∶300稀释的col-IV一抗抗体，1∶2 000稀释的GAPDH一抗抗体，4℃过夜孵育；TBST缓冲液洗膜后，加入1∶2 000稀释的二抗抗体，室温孵育1 h；增强化学发光法显影，曝光成像后测定条带的灰度值，计算各目的蛋白的相对表达水平。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 各组FBG、BUN和SCr水平的变化

与NC组比较，DC组大鼠的FBG、BUN和SCr值显著增大(P<0.01)。与DC组比较，DM+NaHS组和DM+PAG组FBG均无显著性差异，DM+NaHS组大鼠的BUN和SCr值显著减小(P<0.01)；DM+PAG组BUN和SCr值较DC组进一步增加(P< 0.01，表1)。

GroupFBG (mmol/L)BUN (mmol/L)SCr (μmol/L)NC5.75±0.867.15±0.7226.34±2.57DC24.96±3.62∗∗14.85±1.60∗∗43.60±3.24∗∗DM+NaHS22.48±3.4511.69±1.23##35.28±3.01##DM+PAG25.83±3.7117.10±1.74##48.52±2.76##

FBG: Fasting blood glucose; BUN: Blood urea nitrogen; SCr: Serum creatinine

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDC group

2.2 各组肾脏胶原纤维和CVF的变化

Masson染色结果(图1)显示：NC组大鼠肾小球和肾小管正常，胶原沉积较少；DC组肾小球和肾小管胶原沉积明显增多。与DC组相比，DM+NaHS组肾小球和肾小管胶原纤维沉积明显减少；DM+PAG组胶原纤维沉积明显增加。

胶原纤维分析结果显示，与NC组相比，DC组胶原容积分数(CVF)从9.56±1.45上升至23.31±3.18(P<0.01)。与DC组相比，DM+NaHS组CVF下降至16.20±2.59(P<0.01)；DM+PAG组CVF上升为27.43±3.62(P<0.01)。

Fig.1The deposition of collagen fibers in rat renal tissues (Masson staining ×400)

A: Normal control group(NC); B: Diabetic control group(DC); C: Diabetes mellitus(DM)+ Sodium hydrosulfide(NaHS)group; D: DM+DL-propargylglycine(PAG)group

2.3 各组肾皮质超微结构的变化

透射电镜结果显示，NC组中肾小球基底膜厚度均一，足细胞的足突形状正常、排列整齐。DC组肾皮质基底膜明显增厚，系膜基质增多，多个足突融合。DM+NaHS组肾小球基底膜厚度明显改善，系膜基质增生减少，足突融合程度较DC组明显减轻。DM+PAG组较DC组损伤进一步加重，基底膜增厚显著、系膜基质增多，足突融合(图2)。

Fig.2Changes of ultrastructure in the different groups(×20 000)

A: Normal control group(NC); B: Diabetic control group(DC); C: Diabetes mellitus(DM)+ Sodium hydrosulfide(NaHS)group; D: DM+DL-propargylglycine(PAG)group

2.4 各组肾脏组织IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平的变化

与NC组比较，DC组肾脏组织IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平显著增高(P<0.01)。与DC组比较，DM+NaHS组IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平明显降低(P<0.01)；DM+PAG组IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平较DC组进一步增高(P<0.01，表2)。

GroupIL-1β (pg/mg)IL-6 (pg/mg)TNF-α (pg/mg)Hyp (μg/mg)NC29.73±3.4549.25±4.83109.24±11.783.09±0.44DC60.58±5.21∗∗87.32±6.84∗∗201.69±20.15∗∗6.07±0.72∗∗DM+NaHS47.26±4.67##73.81±6.37##163.52±18.76##4.85±0.68##DM+PAG68.30±5.09##96.63±6.92##227.55±21.60##7.16±0.75##

IL-1β: Interleukin-1β; IL-6: Interleukin-6; TNF-α: Tumor necrosis factor-α; Hyp: Hydroxyproline

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDC group

2.5 各组肾脏组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3和col-IV蛋白表达水平的变化

与NC组比较，DC组肾脏组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad3/Smad3和col-IV水平显著增高(P<0.01)。与DC组比较，DM+NaHS组肾脏组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad3/Smad3和col-IV水平显著降低(P<0.01)；DM+PAG组肾脏组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad3/Smad3和col-IV水平较DC组进一步增高(P<0.01，表3，图3)。

Tab.3 Protein expression levels of TGF-β1, Smad3, p-Smad3 and col-IV in rat renal tissues n=8)

TGF-β1: Transforming growth factor-β1; col-IV: Collagen-IV; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDC group

Fig.3The expressions of TGF-β1, Smad3, p-Smad3, col-IV and GAPDH in rat renal tissues tested by Western blot

TGF-β1: Transforming growth factor-β1; col-IV: Collagen-IV; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

3 讨论

糖尿病是由于机体胰岛素分泌相对或绝对不足，出现以持续高血糖为主要特征的代谢紊乱综合征。糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症之一，也是导致慢性肾功能衰竭和终末期肾病的主要原因。糖尿病肾病的主要病理改变是炎细胞浸润，肾小球系膜基质增加，基底膜增厚和间质纤维化[11]。肾脏纤维化是以ECM如col-IV过度积累、异常沉积为特征，最终导致肾小球硬化、肾功能衰竭[12]。Masson染色是常用的检测胶原纤维沉积的方法。此外，Hyp是合成col-IV的主要原料。本实验结果显示，与NC组大鼠比较，DC组大鼠的FBG、BUN和SCr水平显著增加，肾超微结构损伤明显加重，CVF、Hyp含量和col-IV蛋白表达显著增加，表明糖尿病会引发肾脏损伤及肾组织纤维化。

H2S是继一氧化氮和一氧化碳之后发现的第3种内源性气体信号分子，参与体内多个组织系统的生理功能调控[13]。最近的研究表明，外源性H2S具有减轻糖尿病肾脏纤维化的作用[14]，但是其具体机制目前尚不清楚。本实验中，给予外源性H2S的供体NaHS治疗后，虽然H2S对FBG的影响较小，但DM+NaHS组大鼠BUN和SCr水平较DC组明显降低，肾超微结构损伤明显改善，CVF、Hyp含量和col-IV蛋白表达明显降低；而给予CSE的阻断剂PAG干预后，DM+PAG组大鼠BUN和SCr水平增高，肾超微结构损伤加重，CVF、Hyp含量和col-IV蛋白表达较DC组均进一步提高，提示H2S在调节糖尿病大鼠肾脏损伤和纤维化过程中发挥重要的作用，且外源性H2S可明显减轻糖尿病肾脏纤维化。

TGF-β1是肾脏中所有类型的细胞均能够合成的一种促纤维化介质。在纤维化疾病中，促炎因子TNF-α可诱导TGF-β1表达上调[15]。在糖尿病大鼠肾脏中，TGF-β1表达明显增高[16]。TGF-β1还可激活ECM基因的转录、抑制ECM降解，并诱导肾小管内皮细胞向肌成纤维细胞分化[17, 18]。Smads家族是TGF-β1作用的关键性细胞内信号分子。其中，Smad3可被TGF-β1磷酸化，进而调节下游靶基因的转录[19]。研究发现TGF-β1/Smad3信号通路是引起多种器官组织如肝、心、肺等纤维化的中心路径[20-22]。本实验结果显示，与NC组相比，DC组中促炎因子如IL-1β、IL-6和TNF-α释放明显增多，TGF-β1、Smad3、p-Smad3和p-Smad3/Smad3的表达水平均显著增加，这表明TGF-β1/Smad3通路在STZ诱导的糖尿病大鼠肾纤维化过程中高度活化。NaHS处理后，DM+NaHS组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α释放明显降低，TGF-β1、Smad3、p-Smad3和p-Smad3/Smad3表达水平明显下调；而DM+PAG组中，IL-1β、IL-6和TNF-α释放以及TGF-β1、Smad3、p-Smad3和p-Smad3/Smad3表达水平较DC组均进一步增高，提示H2S可通过减少促炎因子释放，下调TGF-β1/Smad3通路减轻糖尿病大鼠肾脏纤维化。

综上所述，H2S对糖尿病大鼠的肾脏纤维化具有重要的调节作用，其机制可能是通过减少促炎因子释放，下调TGF-β1/Smad3通路，进而抑制肾脏col-IV的过量生成，而减轻糖尿病肾纤维化。