血红蛋白总量在运动员生物护照兴奋剂检测中的意义*

汪 军， 张美玲， 王松利， 刘 敏 ， Yannis Pitisladis

(1. 北京体育大学， 北京 100084， 2. The Brighton Centre for Regenerative Medicine (BCRM), University of Brighton, Hillbrow, Denton Road, Eastbourne BN20 7SR, UK)

常规剂量重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin, rHuEPO)注射(50 IU/kg)是体育界常用兴奋剂之一，可以增加红细胞和血红蛋白量而增加有氧或者无氧运动能力, 运动员生物护照(athletic biological passport, ABP)是国际、国内常用检测手段之一[1-4]。ABP的检测原理是利用运动员多次血液指标检测数据，如血红蛋白浓度、红细胞压积、网织红细胞百分比、OFF-score、异常血液参数值(abnormal blood profile score, ABPS)等, 通过一定的统计方法，考虑到运动员年龄、种族、训练周期、是否参与高原训练和受伤或者疾病等等，确定运动员这些指标的最上限和最下限，如果在某次检测过程中，发现某一或者多个指标超出正常范围，则高度怀疑使用血液兴奋剂。最近几年，血浆膨胀剂甘油结合EPO注射也有运动员开始使用，红细胞和血红蛋白的增加被大量增加的血浆量稀释，而出现假阴性结果。也有测试前因为大量丢失水分致血液浓缩而出现假阳性结果。2010年，甘油作为掩盖剂而被WADA列为禁用物质[5]。也有运动员为逃避兴奋剂检测而使用微量rHuEPO注射，缩小尿液和血液EPO阳性检出率窗口期，使血液指标参数检测不超过正常范围，而运动能力出现较大提高，这些为兴奋剂检测提供了新的挑战。但在实际微量EPO注射过程中，这些血液参数指标是否出现阳性？以及在什么时间段会出现阳性？血红蛋白总量指标是否比血红蛋白浓度指标更有效？本研究拟对受试者实施微量rHuEPO注射7周后，观察不同时间段其血红蛋白总量(total hemoglobin, tHb)和其他血液参数，观察这些指标是否超过ABP所规定的正常值范围而被诊断阳性，希望为血液兴奋剂检测运动员生物护照的使用提供实践依据。

1 对象与方法

1.1 实验对象

14名健康青年男性(年龄30±4.6岁，体重 72.7±4.3 kg，身高(178.9±4.7)cm，每周至少3次50 min以上的规律运动，无吸烟饮酒等不良嗜好)，自愿参与本实验且在实验前填写知情同意书，该实验方案受到学校伦理委员会的批准。

1.2 实验方案

14名受试者(E)进行微量rHuEPO(NeoRecormon, Roche, Welwyn Garden City, UK)皮下注射共7周，按照每kg体重20～40 IU进行注射，每周2次。EPO注射期间给予每天口服铁剂105 mg；对照组(C)(n=14)注射等量生理盐水，每日口服安慰剂(用淀粉制作的片剂105 mg)。在注射前第7日、第一次注射后第3、10、17、24、31、38和45日、以及第7周最后一次注射后第7、14、21日分别采取静脉血全自动生化分析仪测试血液基础参数(红细胞数、血红蛋白浓度、红细胞压积等)，改良CO吸入法[6-8](optimised CO rebreathing method)测试tHb以及公式法计算全血、血浆以及红细胞容积的变化情况。观察血液总量参数和浓度参数随注射时间的变化，探讨这些指标在ABP中的使用。

1.3 具体检测设备和方法

血液浓度参数：全自动血液分析仪(SYSMEX KX-21, 希深美康，日本)测试血液基础参数，如红细胞、血红蛋白浓度和红细胞压积、网织红细胞等。

血液总量指标测试：改良CO吸入法(Fluke CO-220, Radiometer ABL 725)测试血红蛋白总量、全血量、血浆量和红细胞量等等。

1.4 统计学处理

所有参数均通过2010Excel收集整理，筛选得出有效数据，用平均值±标准差表示，相关参数用SPSS 17.0进行单因素方差分析，比较注射后不同时间点参数变化与基础值以及实验组与对照组在不同时间点的差异性。

2 结果

2.1 rHuEPO对血红蛋白、红细胞、红细胞压积和网织红细胞的影响

图1显示实验组血红蛋白浓度、红细胞压积在实验第1周开始显著上升，第6周达到峰值，较基础值分别上升9.54%和10.25%，在最后一次注射后第3周虽有下降，但仍维持较高水平，在运动员生物护照显示阳性结果。而安慰剂组的血红蛋白和红细胞压积随时间变化并无明显改变，实验组与对照组相比显著性升高。

Fig.1Changes of HCT and [Hb] on different time points(n=14)

PRE: pre injection; DUR-3D: 3 days after the first injection; DUR1W: 1 week after the first injection; DUR2W: 2 weeks after the first injection; DUR3W: 3 weeks after the first injection; DUR4W: 4 weeks after the first injection; DUR5W: 5 weeks after the first injection; DUR6W: 6 weeks after the first injection; POST1W: 1 week after the last injection; POST2W: 2 week after the last injection; POST3W: 3 week after the last injection； [Hb]: Hemoglobin concentration; HCT: Hematocrit

*P<0.05，**P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group;#P<0.05，##P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group

从图2可以看出实验组的红细胞数在注射第1周开始显著上升，第6周上升至峰值，上升幅度为9.94%，注射结束后第3周尚未恢复至正常值，仍维持较高水平，ABP显示阳性。安慰剂组无明显变化，实验组与对照组相比具有显著性差异；实验组网织红细胞在注射前3周显著上升，但从第4周开始迅速下降，ABP显示阳性安慰剂组没有明显变化，实验组与对照组存在显著性差异。

Fig.2Changes of red blood cell and RET on the different time points(n=14)

RBC: Red blood cell; RET: Reticulocyte

*P<0.05，**P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group;#P<0.05，##P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group

2.2 rHuEPO对血红蛋白总量的影响

图3显示实验组tHb绝对值、相对值均在注射第3周开始显著上升，第5周达到峰值，分别上升10.22%、10.80%，ABP结果显示阳性，而在注射结束后第1周即开始显著下降恢复，第3周基本恢复到正常值，对照组变化不明显，实验组与对照组相比，具有显著性差异。

Fig.3The changes of tHb on different time points(n=14)

tHb: The absolute value of total hemoglobin; tHb (g/kg) : the relative value of total hemoglobin

*P<0.05，**P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group;#P<0.05，##P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group

2.3 rHuEPO对全血量、血浆量和血红细胞量的影响

图4显示总血量在注射后第5周上升2.57%，上升幅度不显著，注射结束后第3周基本恢复正常值，实验组与对照组相比，不具有显著性差异。表示EPO注射不会显著影响血液总量的变化，而且ABP显示阴性结果。

Fig.4Changes of blood volume on different time points(n=14)

从图5可以看出实验组红细胞总量在注射第3周开始显著上升，第5周上升至峰值，幅度为 10.89%，第3周恢复至正常值，对照组无显著性变化，实验组与对照组相比，具有显著性差异；实验组血浆量随时间变化平缓下降，注射结束后第1周下降显著，血液出现浓缩现象。而安慰剂组无明显变化，且实验组与对照组在第5周和注射后第1周存在显著性差异。

Fig.5Changes of red blood cell volume and plasma volume on different time points (n=14)

RCV: Red blood cell volume; PV: Plasma volume

*P<0.05，**P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group;#P<0.05，##P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group

3 讨论

本研究的目的在于通过注射微量rHuEPO，观察其对血液指标(血液总量指标和浓度指标)影响。探讨这些血液指标的变化是否会超过ABP所确定的正常范围；以及总量指标和浓度指标相比，其在运动员生物护照使用中的有效性及时效性是否有区别，以便于为血液兴奋剂ABP的检测提供更加合理的参数指标。

该研究发现，微量rHuEPO注射可以显著性增加红细胞、血红蛋白、红细胞压积等浓度参数，而且一直可以持续到注射后3周左右，这些指标升高的幅度都有显著性差异，在ABP结果显示阳性，而血浆总量的下降导致血液浓缩，所以这些浓度指标上升的结果也可能是血浆浓缩导致；而tHb等血液总量指标在注射后3周才出现显著上升，持续时间到最后一次注射后1周即开始明显恢复到正常水平，其变化趋势非常敏感。尽管这种微量EPO注射方式也能显著提高最大摄氧量和有氧运动能力(数据未给出)；使用血液参数用于运动员生物护照进行检测仍然可以得到阳性结果，但是如果整个周期都用血液浓度参数指标，特别是EPO注射后期，血浆量即开始出现显著下降，相对浓缩的血液会影响这些浓度指标在ABP检测中出现一些错误的判断，因而血液总量指标可能更加有效。而且血液过分浓缩也是导致运动员在运动中猝死常见原因之一。

人体中的EPO是由肾皮质肾小管周围间质细胞分泌的一种激素样物质, 肾外组织缺氧可促进肾脏产生EPO。除肾来源外，人体内有5%～10%的EPO是由肾外组织(如肝)产生的。EPO作为一种糖蛋白激素，是哺乳动物调节红细胞生成的主要调控因子，其主要生理功能包括： EPO通过与受体结合刺激骨髓造血功能，增加红细胞的数量，从而提高血液的携氧能力，同时能够在一定时间内使得血红蛋白含量提高，使红细胞比容增加；高强度竞技时，EPO能够改善缺氧状态，促进肌肉中氧利用，提高肌肉工作效率；稳定红细胞膜结构，维持膜内外渗透压。

rHuEPO与人体内生EP0在结构和功能上非常相似，注射rHuEPO刺激骨髓造血细胞，作用于特定的受体，促进巨幼红细胞的成熟，加快红细胞的生成速度，从而产生一系列的血液参数变化，rHuEPO的注射可以治疗癌症导致的贫血症状[9]，主要包括血红蛋白、红细胞压积、tHb g/kg增多。血浆量下降，总血量变化不大，产生血液浓缩现象[10]。而微计量EPO注射对于严重贫血并没有明显效果，需要用大剂量注射才能有较好的疗效[11]。因为EPO具有很好的增强人体血液运输氧的能力，且可以有效的调节、平衡体内与造血机能有关的生理活动，常被用作体育竞技的辅助药物，从高原训练到血液回输，EPO的滥用引起体育界的广泛关注[12]。在90年代，国际奥委会正式将EPO列为兴奋剂药物，相继也出现了多种检测EPO的方法[13]。国外学者在上世纪80年代对rHuEPO在体育竞技领域的应用进行了大量研究，对于发现使用20 IU/kg～50 IU/kg微量注射rHuEPO能够显著改变红细胞的生成速率，增加红细胞比容，以及一系列的血液参数变化，但其生物护照检测效果并不理想[14]。对于rHuEPO的检测，有直接检测法(采集运动员尿液，电泳检测)和间接测试法(血液参数)[15-16]。直接检测法有一定的时限性，因而存在很大弊端；间接检测法相对来说较简单些，起初学者用血红蛋白浓度[Hb]来检测，但由于甘油、水以及血液膨胀剂的使用会显著影响血红蛋白浓度[17]，以及不同专项运动员的血液参数都存在一定差异[18]，因此血红蛋白浓度在生物护照使用中并不能够很好的检测EPO，而血红蛋白总量tHb在人体内相对稳定，使用改良CO呼吸法测试血红蛋白总量可以更精确的检测EPO[19]。

在本实验中发现微量EPO注射后，血液浓度参数(除网织红细胞外)和总量参数(除血浆量外)都有显著上升，最高点出现在注射第5～6周。而浓度参数指标如血红蛋白浓度、红细胞数、红细胞压积一直持续处于高点直到最后一次注射结束3周都没有恢复到正常值；而总量参数指标如tHb、红细胞总数、血液总量等在注射结束后第1周就开始慢慢恢复到正常水平，持续时间较浓度参数指标较短。网织红细胞在注射前3周维持较高水平，可能是因为EPO注射后，刺激了骨髓红细胞的增生，大量幼红细胞产生，而在注射后期以及停止注射后，幼红细胞大量成熟为正常红细胞，因而网织红细胞开始显著下降，而红细胞总数出现显著上升。另外，在EPO注射后，发现血浆量有显著下降，尤其是在注射第5周和注射结束后第1周下降明显，血液出现浓缩。虽然血液总量指标(红细胞总数和血红蛋白总量)出现明显回复到正常水平，而浓度指标持续维持在较高位水平，应该与血液浓缩有关。而这些往往是运动员在EPO注射后，血液浓缩，血液粘滞性增大，血栓形成导致猝死的主要因素。

综上所述，7周微量rHuEPO注射可以显著增加血液浓度和总量参数，而且血红蛋白总量更加敏感，因此可以用ABP监测微量EPO注射，但浓度参数可能会受到血浆量影响而出现错误判断；总量指标在注射结束后1周左右就开始下降恢复到正常值，而浓度指标一直持续在较高水平3周左右，与血液浓缩有关。