血清中IncRNA-PVT1的检测方法建立及在肝癌诊断中的应用

朱怡卿

【摘要】目的：建立在血清中检测长链非编码RNA （long non-coding RNA，IncRNA）PVt1的方法，并探讨该检测在肝癌诊断中的应用价值。方法：收集肝癌患者血清样本50例，正常志愿者血清样本40例，10对肝癌及癌旁组织样本。分别通过TRIzol和TRIzo LS提取组织和血清中的RNA，通过real-time PCR检测组织和血清中IncRNA-PVTl的相对含量。结果：IncRNA-PVTl在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.01），IncRNA-PVT1在肝癌患者的血清中的表达显著高于正常患者。结论：成功建立了在血清中检测IncRNA-PVTl的方法，血清中IncRNA-PVTl的表达可以作为肝癌诊断的生物标志。

【关键词】血清;检测;肝癌

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一。据报道，全球每年有超过60万肝癌患者去世[1]。尽管外科治疗技术及放、化疗技术的进步极大地改善了肝癌患者的预后，但是当前针对肝癌的有效的治疗手段依然十分有限，肝癌患者，特别是晚期肝癌患者的术后生存率依然不乐观[2]。早期诊断和靶向治疗是肿瘤治疗的新方向，因此，发掘与肝癌发生密切相关的分子标志对肝癌的治疗具有重要的意义。

长链非编码RNA （long non-codingRNA，IncRNA）是指长度超过200bp的一类非编码RNA分子[3]。随着高通量测序技术的发展，越来越多的研究表明，IncRNA在物种间的表达具有较高的保守性和时空特异性，可通过吸附内源性的miRNA，结合蛋白质等方式广泛的参与生命活动调控[4]。同时，大量研究表明IncRNA表达的紊乱与多种疾病的发生发展密切相关。目前，已有研究表明IncRNA-PVTI在肝癌组织中特异性高表达，并可通过调控NOP2蛋白的稳定性、特异性吸附miRNA参与肝癌的发生发展，是肝癌早期诊断和靶向治疗的潜在生物标志。然而，血清中检测IncRNA-PVTl的检测方法，及其在肝癌诊断中的意义仍无报道。因此，本研究拟从肝癌中特异性高表达的原癌基因IncRNA-PVT1入手，建立在血清中检测IncRNA-PVT1的方法，评价血清中IncRNA-PVTl表达检测对肝癌诊断的意义。

1 样本与实验方法

1.1 临床样本

临床样本取自2016年至2017年期间在第二军医大学第三附属医院东方肝胆医院就诊的肝癌患者及正常志愿者，在纳入排除标准下共收集到10对肝癌及癌旁组织，50例肝癌患者血清及40例正常健康志愿者血清。

1.2 RNA提取

采用TRIzol LS试剂（美国Invitrogen公司）提取血清中的RNA。按照说明书提取，最终冻存于-80℃。采用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）提取组织中的RNA。根据试剂说明书进行提取，最终用35μL无酶水溶解RNA，冻存于-80℃。

1.3 real-time PCR检测

采 用PrimeScriptTM RT Reagent Kitwith gDNA Eraser试剂（大连TaKaRa公司）对总RNA进行逆转录。采用SYBRPremix Ex Taq II试剂（大连TaKaRa公司）对合成的cDNA进行扩增，反应体系为10 μL。IncRNA-PVTl的5对不同区段的引物如下：Pl上游引物5'-CGCTTCGCAGTGGAATGGAA-3'，Pl 下 游 引 物5-CC-GTGGCA-TTTCTGGTCTTGT-3：P2上游 引 物5'AAGACGGGCA-CTCACAGACA-3，P2下游引物5'AGC-GTTCTCTGGGCGTTCAT-3：P3上游弓I物5'ACAGAGTCCGTTCAGTGTCAGA-3'，P3 下 游 引 物5'ATT-GGGCTGG-GTCTACACAAGT-3'; P4 上游 引 物5'TGC-TTCGTGCTGATTCCTAGAC-3'，P4下 游 引 物5'TTGC-TCTGTGCTGCCAGTTAG-3'; P5上游引物5'GCCTGAACTTCCTCCTGCTATT-3'，P5下 游 引 物5'ACAC-AAAGTGCATACCTACCCA-3'。GAPDH 的引 物 如下：上游5'-TGAAGGTCGGAGTCAACG GATT-3，下 游5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。

1.4 統计学方法

采用Mann-Whitney分析比较IncRNA-PVT1在肝癌患者血清、志愿者血清中的表达差异，采用配对t检验比较IncRNA-PVT1在肝癌、癌旁组织中表达的差异。使用GraphPad Prism 6.0（ Graphpad SoflwareInc，Caligomia）软件进行所有统计学分析。

2 结果

2.1 IncRNA-PVTl片段在血清中表达的检测

考虑到IncRNA-PVTl长度为1957bp，在外周血中多以片段的形式存在，所以我们针对IncRN-PVTl的不同区域设计了5对检测引物进行检测。分别采用这5对引物，通过实时定量PCR的方法检测5例肝癌患者和5例正常志愿者血清中IncRNA-PVTl的表达。实验结果发现引物l，4，5均能在血清中检测到IncRNA-PVT1表达， 而引物2，3未能检测到IncRNA-PVTl的表达（图1）。进一步的统计学分析显示，引物5检测到的正常志愿者和肝癌患者血清中的IncRNA-PVTI具有显著的统计学差异（P<0.01），所以，我们选择引物5进行后续研究。

2.2 IncRNA-PVTl片段在肝癌患者血清中高表达

为了明确引物5在组织及血清中检测IncRNA-PVTl表达的有效性，我们收集了10对肝癌及癌旁组织样本，以及50例肝癌患者血清和40例正常志愿者血清样本。结果显示，10例组织样本中，8例肝癌组织中IncRNA-PVTl呈显著高表达（P<0.05，图2A），且肝癌患者血清中IncRNA-PVTl的表达显著高于正常志愿者（P>0.01，图2B）。提示血清中IncRNA-PVT1的表达值可能用于检测结肠癌。

3 讨论

近年来，大量研究显示IncRNA在肿瘤的发生发展中具有重要的作用，是潜在的肿瘤早期诊断标志物及肿瘤靶向治疗靶点。其中，IncRNA-PVTI是一种广泛报道的癌胚分子，其表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。但少有文献报道IncRNA-PVTl在肿瘤患者血清中的表达。有研究提示，外周血中难以检测到IncRNA主要是由于IncRNA的长度较长，在血液中不稳定且易断裂，而主要以片段的形式存在于外周血中。Wang等的研究采用多对引物对IncRNA进行扩增后，发现IncRNA的部分片段确实呈高表达且稳定地存在于外周血中。因此，本研究设计了5对针对IncRNA-PVTl不同区段的引物，结果发现引物5的扩增效果最为明显，而引物2和引物3都未能检测出IncRNA-PVTl在血清中的表达，该研究结果表明，在血清中IncRNA-PVTl缺失可能以片段形式存在。采用引物5检测IncRNA-PVTl在组织中的表达，发现大部分组织中IncRNA-PVT1呈高表达。进一步采用较大样本检测发现IncRNA-PVTl在结肠癌患者血清中的表达显著高于正常志愿者，提示血清中IncRNA-PVTl的高表达可能是诊断肝癌的潜在生物标志。

综上所述，本研究建立了稳定的在血清中检测IncRNA-PVTl表达的方法，检测结果表明肝癌患者血清中IncRNA-PVTl的表達显著高于正常志愿者，提示血清中IncRNA-PVTl的表达值可能作为生物标志

诊断肝癌。

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