老鸦瓣黄酮的提取及其体外抗氧化性研究

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(安徽科技学院,安徽 凤阳 233100)

老鸦瓣(Tulipaedulis)为百合科郁金香属药用植物[1]，别名迎春草、光慈姑，是早春开放的一种野花，属多年生草本植物。老鸦瓣除去绒毛后的干燥鳞茎为光慈姑[2]。光慈姑味甘、性寒；具有抑菌、解毒散结、行血化痴之功效；主治咽喉肿痛、痛病、痛症、疮肿、产后痴滞[3]。老鸦瓣富含淀粉、生物碱[4]、黄酮类[5]等物质。生物类黄酮是在植物中分布广泛的一类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分[6]。一些生物类黄酮具有良好的抗氧化活性[7]，目前老鸦瓣的研究主要集中在本草考证[8]、生理生物学特性[9]以及栽培繁育[10]等方面，但对老鸦瓣黄酮[11-12]抗氧化性的研究鲜有报道。目前,安徽蒙城地区有农户大量种植，在该地区老鸦瓣不仅作为一种中药，同时还作为一种保健品和食材。

本试验以乙醇为提取溶剂，采用恒温水浴浸提法提取老鸦瓣黄酮，并通过正交试验优化提取工艺，同时对老鸦瓣黄酮的体外抗氧化活性进行探讨，以期为老鸦瓣黄酮类化合物的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

老鸦瓣由安徽迎春草生物科技有限公司提供。NaNO2(AR，上海弘顺生物科技有限公司)；Vc(AR，上海试四赫维化工有限公司)；Tris(AR，上海化学试剂有限公司)；Al(NO3)3、FeSO4(AR，国药集团化学试剂有限公司)；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(AR，美国Sigma公司)；邻苯三酚(AR，上海振企化学试剂有限公司)；槲皮素标准品(国药集团化学试剂有限公司，批号Lot.No.F20051117)。

1.2 试验仪器与设备

AR2140电子天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司)；Y-800G型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；DT5-4型低速大容量多管离心机(北京时代北利离心机有限公司)；U-T6PC紫外可见分光光度计(屹谱仪器制造(上海)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 老鸦瓣提取工艺流程及其主要影响因素

(1)老鸦瓣提取工艺流程：老鸦瓣样品→去杂→烘干→粉碎过筛→加入乙醇→温水浴浸提→离心→浓缩→冷冻干燥→收集黄酮→计算提取率。

提取率(%) =[(X×D×V)/1 000W]×100%

其中：X为待测液的浓度，单位：mg/mL；D为稀释倍数；V为提取液的体积，单位：mL；W为老鸦瓣质量，单位：g。

(2)单因素试验：分别研究了料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取时间(40、60、80、100、120 min)、乙醇体积分数(45%、55%、65%、75%、85%)对黄酮提取率的影响。

(3)正交试验设计：根据单因素试验结果，以黄酮的提取率为综合考察指标，选定乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取时间(C)三因素三水平，进行正交试验设计[13]。

在单因素试验基础上，设计正交试验，探究3个因素对黄酮提取率的综合影响[14]。正交试验水平与因素见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3.2 黄酮鉴定及其含量的测定 准确称取槲皮素标准品10 mg，60%的乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中，得到0.1 mg/mL槲皮素标准溶液[11]。用硝酸铝法测定黄酮[12]。以槲皮素的含量为横坐标X，绘制标准曲线，方程为Y=1.072 9X+0.002 1，Y表示吸光度，R2=0.999 8。

1.3.3 老鸦瓣黄酮体外抗氧化试验 采用铁氰化钾还原法[15]、DPPH法[16]、邻二氮菲法[17]、邻苯三酚自氧化法[18]分别对老鸦瓣黄酮的DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力的测定，测定3次，取其平均值。

2 结果与分析

2.1 老鸦瓣黄酮提取的单因素试验

2.1.1 料液比对老鸦瓣黄酮提取率的影响 由图1可知，随着料液比的增加，老鸦瓣黄酮的提取率先升高后趋于平缓，说明此时老鸦瓣黄酮已经充分溶解，黄酮提取率不再发生变化，这与皇甫阳鑫提取银杏叶黄酮考察料液比的结果一致[18]。

图1 不同料液比对黄酮提取率的影响

2.1.2 提取时间对老鸦瓣黄酮提取率的影响 由图2可知，随着提取时间的增加，老鸦瓣黄酮的提取率先升高后下降，提取时间不足，老鸦瓣黄酮未能完全溶出，提取时间过长，引起老鸦瓣黄酮分解或损失，从而导致提取率降低。

图2 不同提取时间对黄酮提取率的影响

2.1.3 乙醇体积分数对老鸦瓣黄酮提取率的影响 由图3可知，随着乙醇体积分数的增大，老鸦瓣黄酮的提取率先升高后下降，因为不同体积分数的乙醇改变了相应的水溶液极性，老鸦瓣黄酮在乙醇体积分数为65%时溶出性较好。

图3 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

2.2 正交试验结果

2.2.1 正交试验结果 采用L9(34)正交表进行试验，试验每组平行测定3次，各取平均值，通过之前的线性回归方程计算结果并进行分析。计算与分析结果见表2～3。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析结果

由表2～3可知，极值R的大小显示3种因素对老鸦瓣黄酮的提取率存在着不同的影响，其相应的影响大小顺序依次是A>C>B，在5%的相对水平上，乙醇的体积分数和提取时间对老鸦瓣黄酮提取率的影响相对于料液比较为显著，有数据结果可知，选择A2、B1、C2这个组合作为老鸦瓣黄酮提取的最佳组合，提取率为3.46 %。

2.2.2 验证试验 根据正交试验得到的结果，老鸦瓣黄酮提取的最佳组合是A2、B1、C2，按照此条件对该结果进行验证试验，此条件时的黄酮提取率平均为3.47%(表4)。

表4 验证性实验结果

2.3 老鸦瓣黄酮体外抗氧化能力

2.3.1 老鸦瓣黄酮对DPPH自由基清除能力 由图4可知，老鸦瓣黄酮对DPPH自由基有一定的清除能力，在不同浓度时对DPPH自由基清除能力呈现一定的线性关系，在浓度5 mg/mL时清除率可达63.57%。

图4 DPPH自由基清除能力测定

2.3.2 老鸦瓣黄酮对羟基自由基清除能力 由图5可知，老鸦瓣黄酮对羟基自由基有一定的清除能力。老鸦瓣黄酮在不同浓度时对羟基自由基清除能力呈现一定的线性关系，在浓度5 mg/mL时清除率可达53.97%。

图5 羟基自由基清除能力测定

2.3.3 老鸦瓣黄酮对超氧阴离子自由基清除能力 由图6可知，老鸦瓣黄酮对超氧阴离子自由基有一定的清除能力。老鸦瓣黄酮在不同浓度时对超氧阴离子自由基清除能力呈现一定的线性关系，在浓度5 mg/mL时清除率可达44.53%。

图6 超氧阴离子自由基清除能力测定

3 结论与讨论

老鸦瓣作为营养保健型中草药正日益受到消费者关注，其研究与开发也在逐步深入。本试验通过正交试验优化试验设计结果得出老鸦瓣黄酮的最佳提取条件为：料液比1∶20(g/mL)、乙醇体积分数65%、提取时间为80 min、提取温度65 ℃，老鸦瓣黄酮提取率可达3.46 %。从试验结果可知，老鸦瓣黄酮具有一定的抗氧化能力，且随着黄酮浓度增大而增加，对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的最高清除率分别达到63.57%、53.97%、44.53%，为老鸦瓣的进一步开发利用提供实验和参考依据。

在方差分析中可以看出料液比对老鸦瓣黄酮提取率的影响并无显著性，提取时间对其影响较为显著，而乙醇体积分数对其影响最为显著。乙醇是极性溶剂，黄酮化合物具有酚羟基，是一种常见的极性基团，根据相似相溶原理，老鸦瓣黄酮在乙醇体积分数为65%溶出性最好，乙醇体积分数过高或过低，都会影响老鸦瓣黄酮的提取率。