浙江大豆核心亲本蛋白质和异黄酮含量的分析

郭丹丹 袁凤杰 郁晓敏

(浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，杭州 310021)

大豆能为人类和动物提供优质蛋白和油脂，且含有多种生物活性物质，如大豆异黄酮、大豆皂苷和大豆磷脂等。大豆异黄酮是一种多酚类的混合物，是在籽粒成熟过程中积累起来的次生代谢产物。大豆异黄酮在预防和治疗癌症、心血管疾病、骨质疏松症和妇女更年期综合症中起着重要的作用[1-2]。迄今为止，已在大豆籽粒及豆制品中分离出12种大豆异黄酮异构体，包括黄豆苷类、染料木苷类和黄豆黄素苷类三大类，以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型和丙二酰基葡萄糖苷型4种形式存在[3-4]。

不同大豆品种的蛋白质和异黄酮含量存在显著差异，而这种差异直接影响其生产的豆制品品质。在豆制品加工市场中常以蛋白质和异黄酮含量均高的大豆品种作为首选材料，因此同时改良蛋白质和异黄酮含量能够提升大豆品质性状，从而提高其经济价值。梁慧珍等[5]测定了F13代重组自交系群体(晋豆23号×灰布支)474个家系的蛋白质和异黄酮含量，发现蛋白质与异黄酮含量呈显著负相关(r=-0.342)。杨雪峰等[6]对生长在黑龙江省的150份野生大豆进行了研究，结果表明蛋白质与异黄酮含量间同样存在显著负相关性(r=-0.367)。Chiari等[7]分析了IAC-100(高异黄酮和正常蛋白质含量)和BARC-8(低异黄酮和高蛋白质含量)杂交获得的F2代，发现其蛋白质与异黄酮含量也具有负相关关系(r=-0.47)。然而，Charron等[4]分析了17个栽培大豆品种蛋白质和异黄酮的含量，发现其中5个品种的蛋白质与异黄酮含量具有显著的正相关关系(r=0.67～0.85)。

浙江省是我国高蛋白大豆的主产省份之一，而豆制品一直都是浙江人民推崇的传统食品。然而，浙江省内大豆主栽品种的异黄酮含量普遍偏低[8]。通过常规育种来改良大豆中蛋白质和异黄酮的含量，能够有效提高大豆产品的市场竞争力。因此，在大豆育种与遗传改良中对不同大豆种质的蛋白质和异黄酮特性研究越来越多，但是在浙江省，这两类物质之间的关系却少有研究。本研究利用在浙江省种植的196份大豆核心种质，测定其蛋白质和异黄酮的含量，分析了蛋白质和异黄酮各成分以及异黄酮总含量之间的相关性，进而深入了解蛋白质和异黄酮成分与大豆品质之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

以收集、保存的省内外大豆种质为基础，利用SSR技术，杭州国家大豆改良分中心构建了1个核心种质库，作为亲本用于浙江及周边地区的大豆科研与生产，本研究选取了196份核心亲本作为研究对象，其中94份材料来自黄淮海地区，102份材料来自南方地区(表1)。所有材料于2010年夏种植于浙江省农业科学院实验农场，按小区(1×1.5 m)种植，成熟后收获种子，风干，保存待分析。用近红外分析仪测定蛋白质含量[5]，用高效液相色谱(HPLC)法测定异黄酮含量[7-8]。

Foss Infratec 1241 Grain Analyzer近红外分析仪：丹麦福斯公司；Agilent 1100高效液相色谱：美国安捷伦公司。

表1 参试材料基本信息表

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质的测定

使用Foss Infratec 1241 Grain Analyzer近红外分析仪测定蛋白质含量(g/kg)，每份材料3次重复。

1.2.2 异黄酮的提取及测定

称取约50 g籽粒样品于50 ℃烘至恒重，使用手提式高速中药粉碎机磨粉，过60目筛，保存于干燥器中备用。

称取0.25 g大豆粉于离心管中，加入1.5 mL甲醇和0.1 mol/L盐酸的混合液(体积比3:1)，200 r/min充分震荡2 h，10 000 r/min离心5 min，取上清液过0.45 μm的滤膜至上样瓶中，利用Agilent 1100高效液相色谱系统分析异黄酮以及其组分的含量(mg/kg)。

色谱柱为Agilent SB-C18柱，其中流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流动体系为(A%/B%)：0 min(100/0)，30 min(50/50)，35 min(100/0)；流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为37 ℃，进样品量为5 μL。

大豆异黄酮12种组分标准样品为黄豆苷、黄豆黄素苷、染料木苷、丙二酰黄豆苷、丙二酰黄豆黄素苷、乙酰黄豆苷、乙酰黄豆黄素苷、丙二酰染料木苷、黄豆苷元、乙酰染料木苷、黄豆黄素苷元和染料木苷元。

根据异黄酮组分标样的保留时间对样品进行定性，根据标准峰峰面积分别确定样品中异黄酮12个组分的含量，每份材料3次重复，样品异黄酮总含量为各组分含量之和。

1.2.3 数据分析

利用SPSS(Version 17.0)对蛋白质和异黄酮数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 蛋白质含量分析

196份核心亲本蛋白质含量的范围为352～501 g/kg，集中分布在430～475 g/kg之间(图1)。所有参试材料的蛋白质含量平均值为448 g/kg，显著高于以往的报道[9-11]。在196份材料中，羊眼豆(ZDD17457)和羊头十月青(ZDD17203)的蛋白质含量最高，分别为501、492 g/kg；而含量最低的为酱黄豆(ZDD10812)，为352 g/kg。在本研究中，检测到的蛋白质含量最高水平与以往的研究结果[10-11]基本类似，但是这些材料蛋白质含量的差异显著，变异丰富，通过大规模筛选可以获得高蛋白大豆种质，为蛋白改良提供优质亲本资源。

图1 参试材料蛋白质含量分布

针对参试材料的原产地做进一步的归类与分析，结果表明南方地区102份种质的蛋白质平均含量(456 g/kg)显著高于黄淮海地区94份种质(439 g/kg)(表2)。此外，蛋白质含量最高的2个参试品种，羊眼豆(ZDD17457,云南)和羊头十月青(ZDD17203,广西)均源于我国南方地区。以上研究表明，与我国黄淮海地区相比，南方地区更能够生产出高蛋白大豆。

表2 2个生态区域大豆蛋白质和异黄酮组分含量的比较

注：不同小写字母表示同一行之间的显著性差异(P<0.05)。

2.2 异黄酮成分分析

利用HPLC法对参试材料进行异黄酮成分分析，发现12种组分均存在较大差异(表2)。其中，丙二酰染料木苷、丙二酰黄豆苷、黄豆苷和染料木苷这4种异黄酮成分的含量最高，平均含量分别为966.4、667.2、206.0、229.3 mg/kg，其含量最高的4个品种分别为响水黑豆(ZDD17256)、74-424(ZDD11588)、中豆31(ZDD24842)和邯豆3号(ZDD23957)。与此相反，196份大豆材料游离型苷元(黄豆黄素苷元，黄豆苷元和染料木苷元)平均含量均低于10 mg/kg。染料木苷元和黄豆黄素苷元含量相对较低，但这两类异黄酮组分具有多种药理作用，如提高免疫系统和预防慢性疾病等[12-13]。在所有参试材料中，响水黑豆(ZDD17256)的染料木苷元含量和黑豆(ZDD25140)的黄豆黄素苷元含量最高，分别可达98.5、28.3 mg/kg。

通过对参试材料的原产地做进一步分析，我国南方地区102份大豆种质黄豆苷和染料木苷的平均含量均显著低于黄淮海地区94份种质，而2个地区的丙二酰染料木苷和丙二酰黄豆苷平均含量则无显著差异。此外，南方地区大豆种质的黄豆黄素苷元平均含量也显著低于黄淮海地区。这些结果与以前的研究报道基本一致[8,14]。并且，南方地区黄豆黄素苷、乙酰黄豆苷和乙酰黄豆黄素苷的平均含量均显著低于黄淮海地区。以上结果表明，我国黄淮海地区大豆异黄酮主要成分的含量均高于南方地区。

2.3 异黄酮总含量分析

196份参试材料异黄酮总含量呈正态分布(图2)，其含量变化范围为254.1～6 068.9 mg/kg，平均含量为2 463.3 mg/kg，集中分布在1 700～3 100 mg/kg。本研究中观测到异黄酮总含量的平均含量与梁慧珍等[5]和刘广阳等[15]的报道接近，但是低于Zhang等[16]的报道。其中响水黑豆(ZDD17256)、刺猬子黄豆(ZDD11697)、74-424(ZDD11588)和中豆31(ZDD24842)4个品种的异黄酮总含量最高，分别为6 068.9、5 248.9、5 142.6、5 087.2 mg/kg。异黄酮总含量最低的5个品种为石芽黄(ZDD17227)、迟黄豆(ZDD12023)、曙光黄豆(ZDD11703)、小花豆(ZDD11467)和大粒黄皮(ZDD21232)，其含量分别只有254.1、429.7、673.0、771.8、978.8 mg/kg。这些异黄酮总含量不同的大豆种质，可以作为新材料用于大豆育种与遗传改良研究。

此前袁凤杰等[8]的报道显示，我国黄淮海地区大豆异黄酮总含量显著高于南方地区(P<0.05)。在本研究中，2个地区大豆种质异黄酮中的一些组分含量存在显著差异，但是总含量并没有表现出明显差异(表2)。因此，外界环境(温度、光照、湿度等因素)对于大豆异黄酮的积累具有重要的影响。

图2 参试材料异黄酮总含量分布

2.4 相关分析

对大豆异黄酮各成分及其总含量相关性分析，发现异黄酮各组分与异黄酮总量之间存在正相关(表3)。异黄酮总含量与乙酰黄豆黄素苷和染料木苷元的相关系数最高，分别为0.874和0.843。异黄酮中的2个主要成分丙二酰染料木苷和黄豆苷，与异黄酮总含量均呈极显著正相关(r=0.841，r=0.814)，这些结果与以前的报告是一致的[8]。但是，异黄酮总含量与黄豆黄素苷、乙酰黄豆苷、乙酰染料木苷和丙二酰黄豆苷之间的相关性均在50%以下。因此，对于这些异黄酮组分含量的选择，不能仅凭异黄酮总含量的高低来判断。此外，染料木苷和乙酰黄豆黄素苷以及染料木苷和黄豆苷之间都存在着显著正相关的关系(r=0.886，r=0.852)，其表明染料木苷、黄豆苷和乙酰黄豆黄素苷在大豆籽粒生长中同步积累。

表3 蛋白质与异黄酮以及各组分间相关性分析

注：*表示差异达显著水平(P<0.01)，**表示差异达极显著水平(P<0.05)。

对蛋白质和异黄酮之间做进一步的相关性分析，蛋白质与染料木苷和黄豆黄素苷元之间均具有显著负相关关系(r=-0.322，r=-0.322)。以往的研究表明，大豆蛋白质含量与异黄酮总含量之间存在弱负相关性(r=-0.342，r=-0.416)[5,15]。因此，选育高蛋白和高异黄酮大豆是存在可能的。本研究中，广西地方品种响水黑豆(ZDD17256)蛋白质含量和异黄酮总含量分别为473 g/kg和6 068.9 mg/kg，湖北地方品种72-424(ZDD11588)蛋白质含量和异黄酮总含量分别为475 g/kg和5 142.6 mg/kg。这2份高蛋白、高异黄酮种质可以作为特异材料用于今后的大豆育种和遗传改良研究。

3 结论

不同大豆品种具有不同的加工用途，大豆籽粒中蛋白质和异黄酮的含量直接影响豆制品品质。本研究中，196份参试材料的蛋白质和异黄酮含量均存在明显差异。我国南方地区大豆种质的蛋白质含量明显高于黄淮海地区，而2个地区异黄酮总含量则无显著差异。然而，这2个地区异黄酮主要成分之间仍表现出显著差异。结果表明，蛋白质与染料木苷和黄豆黄素苷元之间均存在负相关的关系，但是蛋白质与总异黄酮仅存在弱负相关关系。因此，大豆籽粒的蛋白质与异黄酮性状能够同时进行改良，通过筛选和育种改良大豆品质，可以获得高蛋白、高异黄酮大豆。

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