性激素对雌、雄尼罗罗非鱼消化酶活性和摄食基因表达的影响

岳蒙蒙，赵金良

( 上海海洋大学，农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306 )

脊椎动物雌、雄生长差异受摄食、消化、生长与生殖能量配置等影响[1]。鱼类存在着两性生长差异现象，对鳜鱼(Sinipercachuatsi)、罗非鱼(Oreochromis)等研究发现，雌雄生长差异出现与其性成熟时间相关[2-3]。尼罗罗非鱼(O.niloticus)雄鱼较雌鱼生长更快，且在性成熟时差异更加明显，推测雌雄生长差异受体内性类固醇激素影响[4]。在罗非鱼中发现，11-酮睾酮可通过提高摄食量使雄性迅速生长。

脑肠肽是一类广泛分布于中枢神经系统和消化道的多肽，多由消化道分泌作用于下丘脑的摄食调节中枢，直接或间接参与摄食调节，主要分为摄食促进作用和摄食抑制作用[6]。脑肠肽ghrelin是迄今发现的唯一一种具有摄食促进作用的脑肠肽[5]，Jönsson等[7]发现不同喂养条件下虹鳟(Oncorhynchusmykiss)血清脑肠肽含量与进食量呈正相关。Sakurai等[8]发现了与G蛋白偶联的重要神经肽食欲素，摄食状态中尼罗罗非鱼食欲素基因前体的表达量较摄食前、摄食后均有显著性提高，预示食欲素可能作为摄食信号参与摄食调控[9]。神经肽Y于1982年从猪脑中首次分离，属于多肽家族，是一种内源性促食欲因子[10]。饥饿使鲫鱼(Carassiusauratus)、银大麻哈鱼(O.kisutch)脑中神经肽mRNA表达量增加，重新投喂饵料后将产生相反影响[11-12]。1994年，从肥胖小鼠中克隆出OB基因，其编码信号肽命名为瘦素，在金鱼中外周和中枢注射瘦素均会降低摄食[13-14]。研究发现，草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、青鲈(Nibeajaponica)禁食后，胆囊收缩素基因表达量显著降低，胆囊收缩素是摄食调控因子[15-16]。

摄食是鱼类获取营养和能量的唯一途径，为个体存活、生长、发育及繁殖提供物质和能量基础。鱼类的摄食消化能力直接影响生长速度，一般而言，摄食消化能力强则个体生长较快。已有研究表明，金钱鱼(Scatophagusargus)2龄以下雌性生长快于雄鱼，与其具有较高的摄食量、食物转化率、蛋白酶和淀粉酶活性有关[17]；在灰海马(Hippocampuserectus)中发现，相同饲养条件下，雌性蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶显著高于雄性，推测雌性需要更多能量用于性腺发育[18]。目前，关于性类固醇激素对雌雄尼罗罗非鱼摄食基因及消化酶的研究未见报道，笔者通过测定雌雄尼罗罗非鱼脑肠肽、瘦素、神经肽Y、食欲素、胆囊收缩素mRNA表达量，结合淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，探究性类固醇激素对雌雄鱼摄食消化的影响，为尼罗罗非鱼养殖提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

尼罗罗非鱼取自于上海海洋大学罗非鱼种质资源试验站，为新吉富罗非鱼(O.niloticus)，全长为(15.9±1.3) cm，体质量为(62.2±13.1) g。运回实验室后，在0.6 m×0.5 m×0.4 m室内控温循环水族箱中暂养两周以适应新环境，水温(23±0.8) ℃。暂养期间日投喂两次，分别为8：00、18：00，试验前12 h不投喂。

1.2 试验方法

雌雄试验鱼分别分为3组，即雌二醇处理组、睾酮处理组和对照组，每组3个重复，每个重复5～6尾鱼。雌二醇和睾酮均为美国Sigma公司产品，无水乙醇溶解后植物油稀释(1∶10，体积比)后腹腔注射，剂量为50 μg/g，对照组仅注射无水乙醇∶植物油=1∶10(体积比)混合液。

注射后第6、12、24 h全部采样，进行生物学测定之后，置于冰盘上解剖，取出脑组织，于冰箱-80 ℃保存备用；在冰上分离出胃、肠组织，清除脂肪和内容物备用、剔除脂肪和结缔组织。

1.2.1 胃、肠组织蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性测定

胃、肠组织先用4 ℃冰冻蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干迅速称量质量并放入标记管中，置于冰箱-80 ℃保存。取出样本，分别加20倍4 ℃蒸馏水冰浴匀浆，匀浆液于冰箱4 ℃静置1 h后，4 ℃，3000 r/min离心30 min，取上清液于冰箱4 ℃保存，24 h内测定酶活力。

采用福林—酚试剂法测定蛋白酶活性，以37 ℃水浴15 min，每分钟内水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸作为1个酶活力单位(U)。

淀粉酶活性测定以可溶性淀粉为底物，采用3，5-二肖基水杨酸显色法，在pH 6.9和25 ℃条件下，每分钟催化淀粉生成1 mg麦芽糖定为一个酶活力单位(U)[17]。

脂肪酶活力采用南京建成脂肪酶试剂盒测定。脂肪酶活性定义，1 g组织样品在37 ℃测定条件下，每分钟水解对硝基苯磷酸二钠盐产生1 μmol对硝基苯酚定义为1个酶活性单位(U)。

1.2.2 摄食相关基因相对表达

1.2.2.1 总RNA提取

使用CWBio公司Trizol试剂盒提取脑组织中总RNA，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，用One DropTMSpectrophotometer测定总RNA纯度及含量，-80 ℃低温保存。

1.2.2.2 cDNA的合成

将总RNA稀释至500 ng/μL，使用CWBio公司SuperRT cDNA Synthesis Kit进行RT-PCR扩增，具体操作按试剂盒说明进行，反转录产物放入4 ℃冰箱保存。

1.2.2.3 引物设计

参照GenBank中罗非鱼摄食相关基因脑肠肽、瘦素、食欲素、神经肽Y、胆囊收缩素、β-actin cDNA序列，用Primer premier 5.0软件设计各基因特异性引物(表1)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 实时荧光定量PCR所用引物

1.2.2.4 实时荧光定量PCR扩增

Real-time PCR扩增参照UltraSYBR Mixture说明书进行，扩增程序为：95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；95 ℃ 15 s, 65～95 ℃熔解。所有样品重复3次，根据结果调整扩增反应体系，使目的基因和内参基因扩增效率接近100%。用2-ΔΔCt法计算摄食基因mRNA相对表达水平[19]。

1.2.3 数据处理

所有数据均用Excel 2007软件进行分析，试验结果以平均值±标准差表示，使用SPSS 19.0软件进行差异显著性分析，利用单因素方差分析法对数据进行方差分析，差异显著时用Duncan′s法多重比较，P<0.05为差异显著。采用Sigma Plot 10.0制作图表。

2 结 果

2.1 注射雌二醇、睾酮雌雄鱼胃、肠道消化酶活性的影响

注射后12 h时，胃总蛋白酶活性最高，对照组雄鱼胃蛋白酶活性显著高于雌鱼(P<0.05)，其他时间点雌、雄鱼活性差异不明显。外源性类固醇激素对雌、雄鱼胃蛋白酶活力影响不明显(P>0.05)(图1)。

对照组雌、雄鱼淀粉酶活性差异不明显，12 h肠总淀粉酶活性最高。24 h体外注射睾酮显著升高雄鱼肠总淀粉酶活性，其他时间外源性类固醇激素对雌、雄鱼肠总淀粉酶活力影响不明显(P>0.05)，注射第12 h，肠总淀粉酶活性最高(图2)。

12 h时，雄鱼肠总脂肪酶活性显著高于雌鱼(P<0.05)，其他时间点雌、雄鱼差异不明显，12 h对照组雌、雄鱼肠总脂肪酶活性最高。外源性类固醇激素对雌、雄鱼肠总脂肪酶活力影响不明显(P>0.05)(图3)。

图1 性类固醇激素对雌、雄尼罗罗非鱼胃总蛋白酶活性的影响

图3 性类固醇激素对雌、雄尼罗罗非鱼肠总脂肪酶活性的影响

2.2 注射雌二醇、睾酮对摄食基因表达量的影响

2.2.1 脑肠肽mRNA

注射雌二醇、睾酮6 h后显著升高雌鱼脑肠肽mRNA水平(P<0.05)，雌二醇升高效果较睾酮更明显;注射雌二醇、睾酮 6 h后，可快速、明显的提高雄鱼脑肠肽mRNA的表达(P<0.05)，睾酮升高效果较雌二醇更明显，雌二醇、睾酮对雌、雄鱼脑组织脑肠肽mRNA表达的作用显示出明显的性别二态性(图4)。6、12、24 h随时间推移，雌二醇对雌鱼及睾酮对雄鱼脑肠肽mRNA表达量的升高作用逐渐平缓。

图4 性类固醇激素对雌、雄尼罗罗非鱼脑组织脑肠肽mRNA水平的影响

2.2.2 瘦素mRNA

注射雌二醇6、24 h时显著升高雌鱼瘦素mRNA水平(P<0.05)，12 h影响不显著(P>0.05)，注射睾酮显著降低雌鱼瘦素mRNA水平(P<0.05)；6 h雌二醇显著升高雄鱼瘦素mRNA水平(P<0.05)，而其他时间点影响不显著，睾酮显著降低雄鱼瘦素mRNA水平(P<0.05)(图5)。

2.2.3 食欲素mRNA

注射雌二醇12、24 h显著升高雌鱼食欲素mRNA(P<0.05)，对雄鱼影响不明显；相反，注射睾酮24 h时显著升高雄鱼食欲素mRNA(P<0.05)，对雌鱼影响不明显(图6)。

2.2.4 神经肽Y mRNA

性类固醇激素对尼罗罗非鱼脑组织神经肽Y mRNA表达的调节同样存在雌雄差异性。注射雌二醇6 h后，明显促进雌鱼神经肽Y mRNA表达(P<0.05)，对雄鱼表达影响不明显；注射睾酮对雌、雄鱼神经肽Y mRNA表达影响不明显，6 h后可显著升高雄鱼的表达，24 h进一步上调脑组织神经肽Y mRNA表达(图7)。

2.2.5 胆囊收缩素mRNA

注射雌二醇6、12、24 h显著降低雌鱼胆囊收缩素mRNA表达量(P<0.05)，雌二醇对雄鱼无显著影响；睾酮对雌鱼胆囊收缩素mRNA表达无显著影响，6 h后显著降低雄鱼表达量。

图5 性类固醇激素对雌、雄尼罗罗非鱼脑组织瘦素mRNA 水平的影响

图6 性类固醇激素对雌、雄尼罗罗非鱼脑组织食欲素mRNA水平的影响

图7 性类固醇激素对雌、雄尼罗罗非鱼脑组织神经肽Y mRNA 水平的影响

图8 性类固醇激素对雌、雄尼罗罗非鱼脑组织胆囊收缩素mRNA水平的影响

3 讨 论

对脊椎动物来说，摄食能力强则生长更快。有研究发现，性类固醇激素参与调节摄食过程[1]。欧鲈(Percafluviatilis)雌鱼较雄鱼体长更长，雌、雄性别分化明显，在同时升高雌、雄鱼性类固醇激素水平时，食物摄食率降低[4]。在银大麻哈鱼、鲤鱼(Cyprinuscarpio)、大鳞大麻哈鱼(O.tschawytscha)的研究中发现，性类固醇激素升高，引起摄食量相应升高[4]。

消化酶是消化系统分泌的具有催化食物分解的一类酶，其活性的强弱直接影响到鱼类对营养物质的消化吸收，进而影响鱼类生长发育。本试验中，在消化能力方面即饵料效率，雄鱼显著高于雌鱼，12 h对照组雄鱼胃总蛋白酶、肠总脂肪酶活力较雌鱼更高，可能是雄鱼生长快速需要更多能量，因此相应升高消化酶活性来消化食物。除此之外，雄鱼从外界获取更多食物，这与前人研究结果一致，罗非鱼雄鱼较雌鱼摄食量、消化管(胃、肠)、饵料效率、单位重量的摄食率更高[21]。本试验中，除了注射后12 h，睾酮显著升高雄鱼淀粉酶活性，其他时间性类固醇激素对消化酶活性影响不显著，表明消化酶活性大小并不是性类固醇激素调节雌雄生长的主要原因。

本试验中，对照组雌雄摄食基因脑肠肽、瘦素、食欲素、胆囊收缩素、神经肽Y表达量随时间变化不明显，雌二醇和睾酮对雌、雄鱼均表现出明显调节作用，且这种调节作用对胆囊收缩素、脑肠肽、瘦素具有雌、雄差异性：雌二醇显著升高雌鱼、睾酮显著升高雄鱼脑肠肽表达量，6、24 h，雌二醇显著降低雌鱼、睾酮显著降低雌雄鱼瘦素表达量，性类固醇激素可通过调节外周抑制摄食因子瘦素、胆囊收缩素参与调节罗非鱼食欲降低和能耗增加，这与已有研究结果一致。研究表明，对金鱼(Carassiusauratus)中枢及外周注射脑肠肽，具有显著促进摄食和增加体质量的作用[22]。荷那龙罗非鱼(O.hornorum)饥饿4周后，饥饿组中胃组织脑肠肽基因表达量最高的个体较对照组表达量最低的个体增加了47.3倍[23]。鱼类瘦素基因具有抑制摄食、控制体质量的功能[24]。提示雌二醇、睾酮通过对脑肠肽、瘦素基因的调节，进一步升高或降低摄食量，从而影响雌、雄生长。

这些研究结果表明，性类固醇激素影响下，摄食调控因子相互作用，相应调节鱼体摄食机能及能量动态平衡，进一步可能影响罗非鱼雌、雄生长差异的产生。

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