蛋白酶高产菌株的选育

霍明月

摘 要：用严谨的分离纯化方法对土壤中产蛋白酶的菌株进行筛选，再用紫外诱变的方法对土壤中的蛋白酶高产菌株进行筛选，最后对得到菌株进行形态、生理生化的鉴定。已知土壤中产蛋白酶的菌株会使含有蛋白质的培养基产生透明圈，透明圈直径与菌落直径的比值与菌株产蛋白酶量成正比。一般紫外诱变会使菌株发生正诱变。

关键词：蛋白酶；诱变；芽孢杆菌

中图分类号：S188 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180133003

引言

蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽水解，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。在干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白改性中都大量地使用蛋白酶。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清[1]。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。因此，选育出蛋白酶高产菌株至关重要。本实验以树林土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株，采用紫外线照射诱变方法育种，筛选得到高产蛋白酶菌株。

1 材料与方法

1.1 培养基配置与灭菌

配置2瓶200mL1.8%琼脂培养基和2瓶250mL营养琼脂培养基。

取7只试管，每支試管加9mL水，加塞湿热灭菌。取10个平皿，用报纸包成1包，干热灭菌。取1个三角瓶，装入90mL水，加塞湿热灭菌。

1.2 菌株分离筛选

无菌制平板。融化培养基，加入牛奶40mL，倒平皿，每组6皿，贴好标签。

制备菌悬液。取土样10g倒入90mL水中，振荡，静置30s，上清液为菌悬液。

菌液10倍梯度稀释。1mL菌液加入9mL水中，混匀，吸取稀释的菌液再加入到新9mL水中，混匀；以此类推，制备10倍梯度稀释。

涂布法将菌接种于平板上和培养。分别取10-5、10-6、10-7的菌液各100μL，倒置于30℃培养箱恒温培养2d。

1.3 记录分离结果和菌株纯化

观察各平板的菌落周围情况，对有透明圈的菌落进行编号；测定透明圈直径和菌落直径，作好记录；计算透明圈直径（H）与菌落直径（C）的比值；选取H/C比值较大的4株菌分别进行下一步纯化。

菌落纯化。融化培养基，加入牛奶40mL，倒平皿，每组4皿，贴好标签（Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4）；挑取H/C比值较大的菌落进行平板划线（分区划线法），倒置于30℃培养箱恒温培养。

1.4 培养基配置与灭菌

配置1瓶200mL1.8%琼脂培养基。

取12支试管，每支试管加9mL水，加塞湿热灭菌。取10个平皿，用报纸包成1包，干热灭菌。取1个三角瓶，装入250mL水，加塞湿热灭菌。

1.5 紫外诱变

1.5.1 制备菌悬液

取出纯化后的平皿，在平皿中加入蒸馏水2mL，用无菌涂布棒刮取菌苔，移液器取出菌液至无菌试管中，反复冲洗菌苔，一并转移至无菌试管中。直至体积达15mL，用移液器吸打混匀悬浮菌体，至单细胞悬液。

1.5.2 对照组的稀释涂布

吸取1mL菌液加入9mL水的试管中，进行10倍梯度稀释，作为对照（未经紫外照射），分别取10-6、、10-7的菌液各100μL，均匀涂布于牛奶平板上，倒置于30℃培养箱恒温培养。

1.5.3 紫外诱变

剩下的菌液14mL加入1无菌大头针，并置于磁力搅拌器上，搅拌混匀悬浮；打开紫外灯预热20min后，用15W紫外灯进行照射处理2min，打开皿盖计时（需在黑暗条件下操作）。

1.5.4 实验组的稀释涂布

取照射2min的菌液1mL，加入9mL水的试管中，进行10倍梯度稀释，分别取10-4、、10-5的菌液各100μL，均匀涂布于牛奶平板上，倒置于30℃培养箱恒温培养。

1.6 观察与记录诱变结果

观察测量对照处理的菌落透明圈，测定透明圈直径和菌落直径；计算透明圈直径（H）与菌落直径（C）的比值；分析结果原因，挑选菌落，在斜面划线。

1.7 细菌菌株鉴定

1.7.1 培养基制备

淀粉水解培养基：取1支三角瓶，配置100mL的营养琼脂粉和可溶性淀粉0.2g/L培养基；明胶液化培养基：配置50mL的营养肉汤和明胶（8g）培养基，溶化后分装到5支试管中，每支管6mL；半固体培养基：配置50mL半固体培养基，溶化后分装到5支试管中，每支管6mL；三糖铁培养基：配置50mL三糖铁培养基，溶化后分装到5支试管中，每只管8mL；乳糖发酵培养基：配置50mL乳糖发酵培养基，分装到5支试管中，每支管6mL，加入1个杜氏小管；mR：配置50mL mR培养基，分装到10支试管中，每支管5mL；vP：配置50mL mR培养基，分装到10支试管中，每支管5mL；柠檬酸盐培养基：配置50mL柠檬酸盐培养基，溶化后分装到5支试管中，每支管5mL。培养基121℃，15min湿热灭菌，取出后摆斜面；葡萄糖发酵培养基；蔗糖培养基；棉籽糖培养基；山梨醇培养基；纤维二糖培养基；水杨苷培养基；淀粉水解培养基。

1.7.2 进行菌株鉴定并观察与记录结果

半固体穿刺：穿刺接种，培养后观察有无鞭毛结构。

营养琼脂斜面：斜面划线，培养后进行革兰氏染色，镜检，观察菌落特点。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染4个步骤。

三糖铁：穿刺后斜面划线，培养后观察颜色。

柠檬酸盐：斜面划线，培养后观察颜色。

乳糖发酵：接种环划菌（液体接种法），培养后观察颜色。

明胶液化：接种环划菌（液体接种法），培养后观察颜色。

MR：接种环划菌（液体接种法），培养后，加2滴甲基红，观察颜色。

VP：接种环划菌（液体接种法），培养后，加2滴甲液后加2滴乙液，观察颜色。

葡萄糖发酵，蔗糖培养基，棉籽糖培养基，山梨醇培养基，纤维二糖培养基，水杨苷培养基，淀粉水解培养基：液体接种法，培养后观察颜色。

2 结果与分析

2.1 细菌菌株鉴定结果与分析

3 结论

紫外诱变后的产蛋白酶含量不高。本实验最后紫外诱变得到革兰氏阴性菌、短杆菌、无芽孢。为此本组成员对存在问题讨论，由于实验课程有限，本实验组成员对原因进行了猜测：在测量菌落透明圈直径和菌落直径时存在误差；紫外诱变的过程中出现操作性问题。

现今，蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。因此，选育出蛋白酶高产菌株至关重要，本实验组将继续研究蛋白酶高产菌株的选育问题，争取最后得到目的菌株—蛋白酶高产的芽孢杆菌。

参考文献

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[2]王婧，王晓丹，罗晓叶，邱树毅，肖蓓，张小龙，胡鹏刚.酱香大曲中高产蛋白酶功能细菌的筛选及鉴定[J].中国酿造，2015（10）.

[3]李爱芬，孙祖莉，陈敏，等.海产品中蛋白酶产生菌的选育及产酶条件研究[J].海洋科学，2003，27（9）：41-43.

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[5]王吉庄，钟芳，王璋.高水解度大豆肽的制备[J].食品工业科技，2003，24（9）：40-42.

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