基于RAD-seq数据开发烟草多态性SSR标记

李海洋，李荣华，夏岩石，袁清华，张振臣，赵伟才，郭培国*

简单重复序列（simple sequence repeat, SSR）又称为微卫星序列，是以1～6个核苷酸为单位多次串联重复组成的 DNA序列[1]，而基于其开发出的DNA分子标记具有特异性强、共显性、稳定性高以及操作简单等诸多优点，已经广泛应用到大豆、小麦、水稻等作物的遗传研究[2-4]。虽然已有 SSR标记应用于烟草的遗传图谱构建[5]、遗传多样性分析[6]、基因定位[7-8]等方面的研究报道，但与其他作物相比，烟草中可用的SSR标记较少。

根据 EST和基因组的 DNA序列挖掘和开发SSR标记作为传统方法，在其他植物中已经有大量应用[9-10]，在烟草中亦有报道。如根据野生绒毛状烟草基因组的测序结果，分析了SSR位点的组成、分布及特征[11]；利用3种烟草基因组信息，对SSR位点的分布情况进行探索，并设计出SSR引物组合[12]；根据烟草EST序列数据分析了EST-SSR位点信息及分布特征，并设计了一些SSR引物组合[13-15]。但由于常规栽培的普通烟草为异源四倍体，基因组较为复杂[16]，且我国的烟草品种还存在遗传狭窄的问题[17]，开发出的SSR标记多态性水平低[16,18-19]，制约了烟草SSR标记的利用，导致SSR标记在烟草中的研究和应用相对较薄弱。

近年来，在第2代测序基础上建立的简化基因组测序技术，可利用酶切技术、序列捕获芯片技术等其他手段降低物种基因组复杂程度，进而了解物种部分基因组的特性。目前，主要应用的简化基因组测序技术包括复杂度降低的多态序列测序（complexity reduction of polymorphic sequences,CRoPS）[20]、基因分型测序技术（genotyping by sequencing, GBS）[21]、限制性酶切位点相关的DNA测序（restriction-site associated DNA, RAD-seq）[22]。其中应用较为广泛的 RAD-seq是利用酶切技术降低基因组的复杂度，对酶切产生的RAD-tag进行高通量测序，能够开发大量的SNP和SSR标记，而且具有成本低、准确率高、不受参考基因组序列限制等优点[23]。运用该方法，已经在茄子[24]、菠萝[25]、花生[26]等其他植物上开发出 SSR标记并应用于遗传分析。

本研究利用RAD-seq技术，对两份烟草材料进行简化基因组测序，分析SSR位点的数量、重复序列次数、基序类型，大规模开发SSR分子标记，并发现在两个材料之间具有多态性的SSR标记，可降低具多态性SSR标记引物筛选的工作量和成本，为多态性SSR标记的筛选和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试4份烟草材料中“118-3”和“粤烟98”由广东省烟草南雄科学研究所提供，“大叶密合”和“长脖黄”由广东省农业科学院作物研究所提供。其中用于简化基因组测序的两份烟草材料中，“118-3”为广东省特色烤烟品种，“粤烟98”是赵伟才等[27]以“Coker206”为母本、“K326”为父本选育的烤烟新品种。另外两份材料“大叶密合”和“长脖黄”分别为广东省优良的地方晒烟品种和河南省优良地方烤烟品种。2016年3月采取4份烟草材料的新鲜叶片，利用李荣华等[28]改良的CTAB法提取4份烟草材料基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳和微孔板分光光度计检测DNA的质量。

1.2 简化基因组测序

利用RAD-seq技术，对“118-3”和“粤烟98”两份烟草材料的基因组DNA进行简化测序。操作流程简述如下：选用六碱基限制性内切酶 EcoR I酶切基因组DNA，构建RAD文库，利用Illumina MiSeq PE300平台进行高通量测序；测序所得的原始数据进行过滤、质检、评估等分析，获得各个样品的干净读长（clean reads）及序列数据。过滤参数如下：去除含adapter的reads，去除含N比例大于10%的reads，去除低质量reads（质量值Q≤20的碱基数占整条read的50%以上）。

1.3 基因组SSR位点的鉴别及SSR引物的设计

利用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）version 0.7.12软件将过滤后得到的clean reads与参考烤烟基因组K326进行比对，利用MISA（http∶//pgrc.ikpgatersleben.de/misa）软件在read覆盖的参考基因组序列中查找SSR位点。配置参数如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最低重复次数分别为15、6、5、4、4和4，相邻 SSR序列间隔区域长度不小于100 bp。根据SSR位点两翼的序列，利用Primer 3.0软件设计SSR引物。对两份测序样品中共有的 SSR位点进行序列分析，若SSR位点在两份测序材料之间存在重复差异即为多态性SSR。

1.4 PCR扩增和检测方法

PCR反应体系为10 μL，其中包含30 ng/μL的DNA 模板 2 μL；10×PCR Buffer 1.2 μL，10 μmol/L的正反向引物各 0.2 μL；10 mmol/L dNTPs 0.3 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dd H20 6.0 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，适宜退火温度45 s（退火温度视引物的不同而改变），72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃充分延伸10 min。PCR产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，按照郭培国等[29]改良的银染技术进行染色检测PCR扩增产物。

2 结 果

2.1 烟草简化基因组序列的产出和质量检测

烟草简化基因组测序结果显示，“118-3”和“粤烟98”两个烟草样品分别获得45 120 744和50 362 336 clean reads，分别具有6.63 Gb和7.42 Gb的原始数据（表 1）。对原始数据进行质量控制、过滤，2个样品共获得95 480 084个高质量干净读长（HQ clean reads），平均Q30（测序碱基质量值，即测序时错误识别的概率是0.1%、正确率为99.9%的碱基比例）为93.99%，平均GC含量为38.78%。从表1中可以看出，过滤前后差异很小，Q30处于较高水平，表明测序数据可靠；但GC含量处于较低水平，对本试验测序反应影响不大。

表1 RAD-seq基因组测序数据统计表Table 1 Summary of genomic sequences generated by RAD-seq

2.2 烟草简化基因组中SSR位点的频率和分布

运用BWA软件将“118-3”和“粤烟98”简化测序获得的clean reads与参考基因组进行比对，分别比对上44 995 698和50 187 807个reads。在此基础上，利用 MISA软件在比对到参考基因组上的reads覆盖区域中搜索SSR位点，在“118-3”和“粤烟98”中分别检测到19 746和20 340个reads含有1个或以上的SSR位点，其中两份材料中共有SSR位点的reads数为17 941个。两份材料中共检测到22 145个reads上含有25 343个SSR位点；这些含有SSR位点reads中，其中有17 882（80.74%）个reads含有1个SSR位点，剩余的reads含有2个或以上的SSR位点。

在所发现的SSR位点中，完全重复型（P型）所占的比例最大，共计 23 660个，占位点总数的93.35%；复合型（C型）只有 1683个，占位点总数的6.65%（表2）。P型SSR位点中，二核苷酸类型出现比例最高，达 10 513个，占位点总数的41.48%；其次是三核苷酸，为 7631个（30.11%）；单核苷酸和四核苷酸的差别不大，分别为 2595（10.23%）和2108个（8.31%）；五核苷酸和六核苷酸最少，分别只有451（1.77%)和362个（1.42%）。从表2还可以看出，P型SSR位点中，以六核苷酸类型重复序列的平均长度最长，达到 26 bp；四核苷酸的平均长度最短，为17 bp；C型SSR位点的平均长度较长，为28 bp。

在P型SSR位点中共发现298种基序，出现频率最高的基序是AT/TA，为5337个位点，占总SSR位点数的21.06%；随后分别为T/A（2278个位点，8.99%）、AG/CT（1383个位点，5.46%）和TC/GA（1066个位点，4.21%）；此外TTG/CAA（816）、AAC/GTT（834）、AAG/CTT（461）、TTA/ATT（644）、TAT/ATA（539）、TTC/GAA（881）和AAAT/ATTT（805）基序达到总SSR位点数的1.5%以上（表2）。

表2 烟草基因组中的SSR位点的分布信息Table 2 Distribution of SSR loci in the tobacco genome

2.3 烟草基因组SSR位点基序重复次数

烟草不同类型SSR位点基序的重复次数如表3所示。从中可见，单核苷酸的基序重复次数集中在15～18次，二核苷酸和三核苷酸基序重复次数主要分布在6～9次和5～8次，四核苷酸在4～6次，而五和六核苷酸基序的重复次数主要集中在4～5次。从SSR位点基序重复次数来看，以6次基序重复次数的SSR位点数最高，达到5171个SSR位点，占总SSR位点数20.4%；5次和7次重复次数分别为3945和3141个SSR位点，占总SSR位点数15.56%和12.39%。另外，从表3还可以看出，各个SSR位点类型出现的频率均存在随重复次数的增加而逐渐下降的趋势。

2.4 烟草简化基因组SSR引物设计与多态性验证

利用Primer 3.0软件对25 343个SSR位点进行引物设计，成功设计出23 346对SSR引物，引物设计的成功率为 92.12%；根据“118-3”和“粤烟98”两份材料的简化测序数据，初步发现其中有323对引物的SSR位点在两份材料间具有多态性，多态性比例为1.38%。

随机选择50对具有多态性位点的SSR引物，利用两份简化测序烟草材料和另两份烟草种质材料对SSR位点的多态性进行验证（图1），SSR引物信息及验证结果如表4所示。从中可见50对引物在两个简化测序样品中均能扩出清晰的条带，其中有 38对引物的扩增产物具有多态性，多态率达到76%；在另两份种质材料中有48对引物能扩增出清晰条带，有效扩增率达96%，其中有10对引物的扩增产物具有多态性，多态率为20%。

表3 烟草基因组中SSR位点的基序重复次数分布Table 3 Distribution of repeat numbers of SSR motifs in tobacco genome

图1 部分SSR引物在4份烟草材料中扩增产物的银染图Fig. 1 Image of silver staining for PCR amplicons of partial SSR primer pairs in four tobacco genotypes

表4 50对SSR引物在4份烟草材料中扩增产物的多态性分析Table 4 Polymorphic analysis for PCR amplicons of 50 SSR primer pairs in 4 tobacco genotypes

表4 （续）Table 4 (Continued)

3 讨 论

3.1 烟草简化基因组SSR位点分布特征

本研究在两份烟草材料简化基因组中共检测到2种类型SSR位点：P型和C型。P型SSR位点中，二、三核苷酸类型出现的频率最高，达到SSR位点总数的 71.59%，这与童治军等[19]利用 3份烟草基因组序列数据搜索的 SSR位点的基序结果一致，也与其他作物[3,9,30]基因组中SSR位点的分布特征相符。在SSR基序的结构方面，共发现298种重复类型的基序，以T/A、AT/TA、TC/GA、CT/AG、AAT/ATT、AAC/GTT、ACA/TGT、GAA/TTC 和AAAT/ATTT基序最为丰富，此结果与前人在烟草基因组和EST序列研究所得的结果一致[15,19]，但与水稻[9,30]SSR位点中主要基序类型有所不同。另外，C型 SSR位点占总 SSR位点数的 6.65%，低于BOSAMIA等[31]在花生EST序列中检测到10.38%的C型SSR位点，但未有在烟草基因组或EST序列研究中关于C型SSR位点的相关报道。

本研究所获得的reads和检测到的SSR位点中的基序结构中，均存在富含A、T和较低的G、C碱基的情况，且存在SSR位点的基序中G、C出现的越少，则该基序的分布频率越高的现象；这一现象在多种真核生物基因组SSR位点中也有发现[32]。形成这一现象的原因可能是与GC、AT碱基对之间所含的能量相关，即AT比GC更容易变动[19,32]。

3.2 SSR标记的开发和多态性SSR标记

随着新一代高通量测序技术的快速发展，测序的成本和时间大大减少，基于基因组序列开发SSR标记的方法已经成为植物研究中 SSR标记开发的重要手段[33-34]。虽然烟草全基因组测序已经完成[35]，并可根据基因组序列设计出大量的SSR引物组合。但由于常规栽培烟草品种之间亲缘关系较近，可用的SSR标记多态性水平低，从而造成一些研究成本的增加。如刘文杰等[36]选用 1405对由 BINDLER等[1,5]和TONG等[37]开发的SSR引物对烟草青枯病进行定位时，只发现214（15.23%）对SSR引物在两亲本材料间（“118-3”和“粤烟 98”）具有多态性。TONG等[38]选用5718对依据基因组数据开发的SSR引物，对烟草赤星病进行QTL定位时，发现只有227对引物的扩增产物具有多态性，多态率仅为3.96%。刘文杰等[17]选用90对前人开发的SSR引物分析94份烟草核心种质资源的遗传多样性时，只有17对引物检测出34个等位变异位点，平均PIC值只有0.2811。本研究利用简化基因组测序技术开发和设计出23 346对SSR标记引物，并依据两个测序样品间的序列数据，初步发现 323对引物的SSR位点具有多态性，以减少在引物合成及其筛选的成本和工作量。在利用 4份烟草材料对多态性SSR进行验证时，发现在两份测序样品中多态率达到76%，并发现24%的假阳性，可能是因为测序结果有一定的错误率造成，或者是多态性验证时所采用的 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶的分辨率不足，造成一部分多态性SSR标记验证结果错误[38]。同时，在另外两份种质材料中也发现了20%的多态率，该比率高于牟建英等[39]在“台烟 7号”和“NC89”两份烟草材料间得到的 4.8%以及高亭亭等[40]在“Beinhart1000-1”和“小黄金 1025”两份烟草材料间得到的7.2%。值得说明的是，多态性SSR在4份材料之间的多态率高达84%，表明开发的多态性标记不仅能够用于两个测序材料的后续基因定位，也能用于种质资源的遗传多样性分析。另外，一些研究发现，基因组或EST序列中SSR位点的重复序列长度与所开发出 SSR标记的多态性有关，即SSR位点的重复序列越长，多态性出现的概率越大，且认为当SSR位点中重复序列长度≥20 bp，多态性的比例高[33,41]。本研究开发的323个多态性SSR中只有2个重复序列的长度低于20 bp，也表明重复序列的长度与其多态性相关。最后，单从多态性SSR开发和选用前人开发的 SSR的研究成本角度考虑，由于测序技术快速发展，测序分析开发多态性 SSR的研究成本显著低于选用前人开发的 SSR标记，尤其在遗传距离较近的材料中。综上所述，简化基因组测序可快速高效开发烟草多态性 SSR标记，为后续的 QTL定位和遗传多样性分析等研究提供基础。

4 结 论

通过对两份烟草材料“118-3”和“粤烟 98”进行简化基因组测序，共检测到25 343个SSR位点，依据序列设计出23 346对SSR标记引物组合；序列对比发现其中323对SSR引物组合在两份测序材料间具有多态性，试验验证表明其多态率为76%。研究结果表明，简化基因组测序可为烟草具有多态性SSR标记的开发和应用提供参考，亦可为后续的QTL定位和遗传多样性分析等研究提供基础。

[1] BINDLER G, HOEVEN V, GUNDUZ I, et al.Microsatellite marker based linkage map of tobacco[J].Theoretical and Applied Genetics, 2007, 114(2)∶ 341-349.

[2] SONG Q J, JIA G F, ZHU Y L, et al. Abundance of SSR motifs and development of candidate polymorphic SSR markers (BARCSOYSSR_1.0) in soybean[J]. Crop Science, 2010, 50(5)∶ 1950-1960.

[3] EUIJAY I, SORRELLS M E, BAUM M, et al. Isolation of EST-derived micro-satellite markers for genotyping the A and B genomes of wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2002, 104(2)∶ 399-407.

[4] SINGH A K, SINGH P K, ARYA M, et al. Molecular screening of blast resistance genes in rice using SSR markers[J]. Plant Pathology Journal, 2015, 31(1)∶ 12-24.

[5] BINDLER G, PLIESKE J, BAKAHER N, et al. A high density genetic map of tobacco (Nicotiana tabacumL.)obtained from large scale microsatellite marker development[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2011,123(2)∶ 219-230.

[6] 吴超，夏岩石，李荣华，等. 烟草青枯病抗性与分子标记的关联分析[J]. 烟草科技，2015，48（10）：1-12.WU C, XIA Y S, LI R H, et al. Association analysis of tobacco bacterial wilt resistance with molecular markers[J]. Tobacco Science & Technology, 2015,48(10)∶ 1-12.

[7] QIAN Y L, WANG X S, WANG D Z, et al. The detection of QTLs controlling bacterial wilt resistance in tobacco (Nicotiana TabacumL.)[J]. Euphytica, 2013,192(2)∶ 259-266.

[8] LAN T, ZHENG S P, YANG L, et al. Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to bacterial wilt in tobacco (Nicotiana tabacumL.)[J]. Plant Breeding,2015, 133(5)∶ 672-677.

[9] KANTETY R V, ROTA M L, MATTHEWS D E, et al.Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley, maize, rice, sorghum and wheat[J]. Plant Molecular Biology, 2002, 48(5)∶ 501-510.

[10] CHEN H M, LI L Z, WEIX Y, et al. Development,chromosome location and genetic mapping of EST-SSR markers in wheat[J]. Chinese Science Bulletin, 2005,50(20)∶ 2328-2336.

[11] 王卫锋，晁江涛，龚达平，等. 绒毛状烟草基因组中SSR位点的信息分析[J]. 中国烟草科学，2011，32（3）：32-35，40.WANG W F, CHAO J T, GONG D P, et al. Analysis of SSR information inN.tomentosiformisgoodspeed genome[J]. Chinese Tobacco Science, 2011, 32(3)∶ 32-35,40.

[12] 童治军，肖炳光. 3种烟草基因组SSR位点信息分析和标记开发[J]. 西北植物学报，2014，34（8）：1549-1558.TONG Z J, XIAO B G. Survey of SSR loci information in three tobacco genomes and development of SSR markers[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2014, 34(8)∶ 1549-1558.

[13] 张俊娥，李芬，孙蒙祥. 烟草EST-SSR位点分析[J]. 武汉植物学研究，2007，25（5）：427-431.ZHANG J E, LI F, SUN M X. Analysis of EST-SSR loci in tobacco (Nicotiana tabacumL)[J]. Journal of Wuhan Botanical Research, 2007, 25(5)∶ 427-431.

[14] 胡重怡，蔡刘体，陈兴江. 烟草ESTs资源的SSR信息分析[J]. 生物技术通报，2009，25（7）：82-85，93.HU C Y, CAI L T, CHEN X J. Analysis of SSR information in ESTs resource of tobacco (Nicotiana tabacum)[J]. Biotechnology Bulletin, 2009, 25(7)∶ 82-85,93

[15] 薛金爱，赵彦宏. 烟草SSR分布特征与开发利用[J]. 山西农业科学，2011，39（4）：295-298，306.XUE J A, ZHAO Y H. Distribution characteristics and utilization of SSRs inNicotiana tabacum[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2011, 39(4)∶ 295-298, 306.

[16] MOON H S, NICHOLSON J S, HEINEMAN A, et al.Changes in genetic diversity of U.S. Flue-cured tobacco germplasm over seven decades of cultivar development[J]. Crop Science, 2009, 49(2)∶ 498-508.

[17] 刘文杰，李荣华，夏岩石，等. 利用荧光SSR和MFLP标记技术分析烟草核心种质的遗传多样性[J]. 分子植物育种，2016，14（10）：2869-2881.LIU W J, LI R H, XIA Y S, et al. Analysis of genetic diversity for core tobacco germplasm by using fluorescent SSR and fluorescent MFLP marker techniques[J]. Molecular Plant Breeding, 2016, 14(10)∶2869-2881.

[18] MOON H S, NIFONG J M, NICHOLSON J S, et al.Microsatellite-based analysis of tobacco (Nicotiana tabacumL.)genetic resources[J]. Crop Science, 2009,49(6)∶ 2149-2159.

[19] 童治军，焦芳婵，肖炳光. 普通烟草及其祖先种基因组SSR 位点分析[J]. 中国农业科学，2015，48（11）：2108-2117.TONG Z J, JIAO F C, XIAO B G. Analysis of SSR loci inNicotina tabacumgenome and its two ancestral species genome[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(11)∶2108-2117.

[20] ALTSHULER D, POLLARA V J, COWLES C R, et al. An SNP map of the human genome generated by reduced representation shotgun sequencing[J]. Nature, 2000,407(6803)∶ 513-516.

[21] ELSHIRE R J, GLAUBITZ J C, SUN Q, et al. A robust,simple genotyping-by-sequencing (GBS) approach for high diversity species[J]. PloS ONE, 2011, 6(5)∶ e19379.

[22] MILLER M R, DUNHAM J P, AMORES A, et al. Rapid and cost-effective polymorphism identification and genotyping using restriction site associated DNA (RAD)markers[J]. Genome Res, 2007, 17(2)∶ 240-248.

[23] 王洋坤，胡艳，张天真. RAD-seq技术在基因组研究中的现状及展望[J]. 遗传，2014，36（1）：41-49.WANG Y K, HU Y, ZHANG T Z. Current status and perspective of RAD-seq in genomic research[J]. Hereditas,2014, 36(1)∶ 41-49.

[24] BARCHI L, LANTERI S, PORTIS E, et al. Identification of SNP and SSR markers in eggplant using RAD tag sequencing[J]. Bmc Genomics, 2011, 12(1)∶ 304.

[25] URASAKI N, GOEKU S, KANESHIMA R, et al. Leaf margin phenotype-specific restriction-site-associated DNA-derived markers for pineapple (Ananas comosusL.)[J].Breeding Science, 2015, 65(3)∶ 276-284.

[26] GUPTA S K, BAEK J, ACARRASQUILLA-GARCI N, et al. Genome-wide polymorphism detection in peanut using next-generation restriction-site-associated DNA (RAD)sequencing[J]. Molecular Breeding, 2015, 35(7)∶ 145.

[27] 赵伟才，邱妙文，陈杰，等. 烤烟新品种粤烟98的选育及其特征特性[J]. 中国烟草学报，2013，19（4）：35-40.ZHAO W C, QIU M W, CHEN J, et al. Breeding of new flue-cured tobacco variety Yueyan98 and its characteristics[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2013, 19(4)∶35-40.

[28] 李荣华，夏岩石，刘顺枝，等. 改进的 CTAB提取植物DNA方法[J]. 实验室研究与探索，2009，28（9）：14-16.LI R H, XIA Y S, LIU S Z, et al. CTAB-improved method of DNA extraction in plant[J]. Research and Exploration in Laboratory, 2009, 28(9)∶ 14-16.

[29] 郭培国，刘文杰，李海洋，等. 一种快速有效检测 SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法[J]. 广州大学学报（自然科学版），2016，15（4）：8-12.GUO P G, LIU W J, LI H Y, et al. A rapid and effective method of silver staining for detecting SSR markers in nondenaturing polyacrylamide gels[J]. Journal of Guangzhou University(Natural Science Edition), 2016,15(4)∶ 8-12.

[30] LAWSON M J, ZHANG L Q. Distinct patterns of SSR distribution in the Arabidopsis thaliana and rice genomes[J].Genome Biology, 2006, 7(2)∶ R14.

[31] BOSAMIAT C, MISHRA G P, THANKAPPAN R, et al.Novel and stress relevant EST derived SSR markers developed and validated in peanut[J]. PloS One, 2015, 10(6)∶e0129127.

[32] TOTH G, GASPARI Z, JURKA J. Microsatellites in different eukaryotic genomes∶ survey and analysis[J].Genome Research, 2000, 10(7)∶ 967-981.

[33] 李荣华，王直亮，陈静芳，等. 菜薹转录组中 SSR信息与可用性分析[J]. 园艺学报，2016，43（9）：1816-1824.LI R H, WANG Z L, CHEN J F, et al. Analysis of SSR information in transcriptome and their usability in flowering Chinese cabbage[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2016, 43(9)∶1816-1824.

[34] 米奇，龙志成，MUCHUKU J K，等. 基于新一代高通量测序技术开发巨人半边莲Lobelia deckenii的SSR标记[J].植物科学学报，2015，33（6）：847-854.MI Q, LONG Z C, MUCHUKU J K, et al. Development of SSR markers in giant lobeia(Lobeia deckenii) based on next-generation high-through sequencing[J]. Plant Science Jounal, 2015, 33(6)∶ 847-854.

[35] SIERRO N, BATTEY J N, OUADI S, et al. The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato[J]. Nature Communications, 2014, 5(5)∶ 3833.

[36] 刘文杰. 烟草遗传图谱的构建及青枯病抗性与一些农艺性状的QTL定位[D]. 广州：广州大学，2017.LIU W J. Construction of linkage genetic map and QTL mapping for bacterial wilt resistance and some agronomic traits in tobacco[D]. Guangzhou∶ Guangzhou University,2017.

[37] TONG Z J, YANG Z M, CHEN X J, et al. Large-scale development of microsatellite markers inNicotiana tabacumand construction of a genetic map of flue-cured tobacco[J].Plant Breeding, 2012, 131(5)∶ 674-680.

[38] TONG Z J, JIAO T L, WANG F Q, et al. Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to brown spot in flue-cured tobacco (Nicotiana tabacumL.)[J]. Plant Breeding, 2012, 131(2)∶ 335-339.

[39] 牟建英，钱玉梅，任民，等. 烟草白粉病抗性基因的QTL定位[J]. 中国烟草学报，2013，19（4）：105-108.MU J Y, QIAN Y M, REN M, et al. QTL analysis of resistance gene to powdery mildew in tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2013, 19(4)∶ 105-108.

[40] 高亭亭，蒋彩虹，罗成刚，等. 烟草品种 Beinhart1000-1抗黑胫病基因的QTL定位[J]. 植物遗传资源学报，2015，16（2）：330-335.GAO T T, JIAN C H, LUO C G, et al. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to black shank in tobacco line Beinhart1000-1[J]. Journal of Plant Genetic Resources, 2015, 16(2)∶ 330-335.

[41] SINGH H, DESHUMUKH R K, SINGHA, et al. Highly variable SSR markers suitable for rice genotyping using agarose gels [J]. Molecular Breeding, 2010, 25 (2)∶ 359-364.