CD4+CD25+Foxp3+Tregs在自身免疫性甲状腺疾病中的作用研究

黄广英+禤文婷+何灵杰

【摘要】 目的：探討CD4+CD25+Foxp3+Tregs在自身免疫性甲状腺疾病（AITD）中的作用。方法：收集2014年2月-2016年11月在本院进行检查的AITD患者80例为治疗组，其中Graves（GD）患者40例，为GD组；桥本甲状腺炎（HT）患者40例，为HT组；选取健康体检人员20例为对照组。采用流式细胞术检测外周血CD4+T、CD4+CD25+Tregs细胞数量和比例，采用RT-PCR检测外周血Foxp3 mRNA表达水平，采用化学发光法对血清中甲状腺素（TSH）、总三碘甲状腺原氨酸（TT3）、总甲状腺素（TT4）、甲状腺球蛋白抗体（TgAb）和甲状腺过氧化酶抗体（TPOAb）的水平进行测定。结果：三组TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；三组外周血CD4+T细胞数量比较，差异无统计学意义（P>0.05）；GD组外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T细胞的比率与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；HT组外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T细胞的比率明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；GD组和HT组外周血Foxp3 mRNA表达量均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；自身免疫性甲状腺疾病的CD4+CD25+Foxp3+Tregs与TSH、TT3、TT4、TgAb和TPOAb有明显正相关性（P<0.05）。结论：CD4+CD25+Foxp3+Tregs可能在AITD的发生发展进程中起着一定的作用，深入研究CD4+CD25+Foxp3+Tregs在AITD中的作用将有助于建立新的预防和治疗策略。

【关键词】 自身免疫性甲状腺疾病； Graves； 桥本甲状腺炎； CD4+CD25+Foxp3+

【Abstract】 Objective：To study the role of CD4+CD25+Foxp3+Tregs in autoimmune thyroid diseases（AITD）.Method：80 cases of AITD were collected from February 2014 to November 2016 in our hospital.Included 40 patients with Graves（GD），as GD group，40 patients with Hashimoto's thyroiditis（HT），as HT group，20 cases healthy people were selected as the control group.The peripheral blood flow cytometric detection of CD4+T and the number and proportion of CD4+CD25+Tregs cells were detected by flow cytometry，the peripheral blood Foxp3 expression level was detected by RT-PCR，the levels of total thyroxine（TSH），total three triiodothyronine（TT3），total thyroxine（TT4），thyroglobulin antibody（TgAb） and thyroid peroxidase（TPOAb） were measured by chemiluminescence method.Result：TSH，TT3，TT4，TgAb，TPOAb levels of three groups had significant differences（P<0.05）.The peripheral blood of CD4+T of three groups had no significant difference（P>0.05）.Peripheral blood CD4+CD25+Tregs cells and the ratio of CD4+T of GD group compared with the control group，there were no significant differences（P>0.05）.Peripheral blood CD4+CD25+Tregs cells and the ratio of CD4+T of HT group were significantly lower than those of the control group（P<0.05）.Foxp3 mRNA expression of GD group and HT group were significantly lower than that the control group（P<0.05）.CD4+CD25+Foxp3+Tregs of AITD was positively correlated with TSH，TT3，TT4，TgAb and TPOAb （P<0.05）.Conclusion：CD4+CD25+Foxp3+Tregs may play an important role in the occurrence and development of AITD.Further research on the role of CD4+CD25+Foxp3+Tregs in AITD will help to establish a new prevention and treatment strategy.

【Key words】 Autoimmune thyroid disease； Graves； Hashimotos thyroiditis； CD4+CD25+Foxp3+Tregsendprint

First-authors address：Dongguan Peoples Hospital，Dongguan 523000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.005

自身免疫性甲状腺疾病（Auto Immune Thyroid Diseases，AITD）是人类最常见的器官特异性自身免疫性疾病，在人群中的发病率约为5%。随着现代饮食结构的改变和生活节奏的加快，AITD的发病率呈现逐年增高的趋势[1-2]。CD4+CD25+Tregs是近年研究发现的一类具有维持自身免疫稳定的T细胞亚群，它能够识别自身抗原并抑制自身反应性T细胞的免疫反应，在免疫自稳方面起着重要作用[3]。本研究通过患者检测外周血CD4+CD25+Tregs细胞数量和比例的变化，以及Foxp3基因表达情况，与患者体内相关激素和抗体水平等参数进行相关性分析，探讨其在AITD发病机制中的作用，并为免疫调控治疗的策略提供有价值的参考依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年2月-2016年11月在本院进行检查的AITD患者80例，入选标准：（1）符合《内科学》相应诊断标准；（2）抗甲状腺球蛋白抗体和抗甲状腺过氧化酶抗体滴度均明显升高；（3）经检查确诊为Graves病及桥本甲状腺炎患者[4-5]。排除标准：（1）合并严重心、脑血管系统性疾病的患者；（2）检查前进行药物治疗及有相关病史的患者；（3）妊娠期及哺乳期妇女患者[5-6]。所有患者及其家属知情并签订同意书。其中Graves（GD）患者40例，男17例，女23例，年龄36～53岁，平均（40.6±9.3）岁，作为GD组；桥本甲状腺炎（HT）患者40例，男16例，女24例，年龄37～54岁，平均（41.3±10.2）岁，作为HT组；另外选取20例健康体检人员作为对照组，男7例，女13例，年龄35～53岁，平均（39.8±9.1）岁。三组基本资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法 GD组、HT组及对照组患者分别在清晨采集空腹外周静脉血15 mL作为标本，取2 mL静脉血，2000 r/min离心12 min，分离血清，采用化学发光试剂盒对血清中的血清中甲状腺素（TSH）、总三碘甲状腺原氨酸（TT3）、总甲状腺素（TT4）、甲状腺球蛋白抗体（TgAb）和甲状腺过氧化酶抗体（TPOAb）进行检测。主要试剂：抗人CD4-FITC、CD25-PE购买于美国贝克曼库尔特有限公司，人淋巴细胞分离液购买于北京百奥莱博科技有限公司。（1）取5 mL静脉血，将单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）快速进行分离，并取3×105个PBMC加入抗人CD4-FITC和CD25-PE mAb放置于避光环境中进行室温孵育15 min，然后2000 r/min离心12 min，分离血清，采用流式细胞仪对CD4+T、CD4+CD25+Tregs进行检测[7]。（2）取5 mL静脉血分离PBMC，根据试剂说明书的操作要求将提取细胞总的mRNA反转录为cDNA，采用RT-PCR检测外周血Foxp3 mRNA表达水平[8]。PCR反应条件[8]：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性反应45 s，52 ℃条件下退火45 s，72 ℃延伸反应1.5 min，重复35个循环，72 ℃延伸反应15 min，然后进行PCR扩增，扩增后采用1.5%琼脂糖电泳检测扩增产物。控制电泳电压100 V，将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。（3）取5 mL静脉血分离PBMC，采用磁珠分选方法将CD4+CD25+Tregs和CD4+T进行分离，然后将CD4+CD25+Tregs和CD4+T按照1∶1的比例混合并在96孔培养板上接种，向其中加入经过灭活的自身抗原递呈细胞，经抗CD3抗体（100 ng/mL）刺激培养68 h后，吸去部分上清，向每孔加入20 μL的MMT（ 5 mg/ mL）溶液继续培养4 h后结束。将DMSO加入各孔并震荡使其充分溶解后，采用酶标仪测各孔的OD值[9]。计算CD4+CD25+Tregs对CD4+T抑制率。

1.3 统计学处理 采用SPSS 26.0进行处理，所有数据均符合正态分布，计量资料用（x±s）表示，并进行t或F检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，采用线性回归系数法进行相關性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb水平比较 三组TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 三组CD4+CD25+Tregs和CD4+T水平及Foxp3 mRNA表达水平比较 三组外周血CD4+T的细胞数量比较，差异无统计学意义（P>0.05）；GD组外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T细胞的比率与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；HT组外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T细胞的比率明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；GD组和HT组外周血Foxp3 mRNA表达量均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 三组CD4+CD25+Foxp3+Tregs与TSH、TT3、

TT4、TgAb、TPOAb的相关性 AITD的CD4+CD25+Foxp3+Tregs与TSH、TT3、TT4、TgAb和TPOAb具有明显的正相关性（P<0.05），见表3。

3 讨论

自身免疫性甲状腺疾病（Auto Immune Thyroid Diseases， AITD）主要包括Graves病和桥本甲状腺炎，两者均可产生针对甲状腺的自身抗体，是临床上引起甲状腺功能亢进或减退的最常见原因之一，可导致多器官、多系统损害，或合并其他自身免疫性疾病，严重影响患者的心身健康[10-12]。大多数研究认为，AITD是在遗传和环境等因素的相互作用下，诱发机体免疫系统机能失衡，从而产生针对自身抗原的免疫细胞和或自身抗体，导致器官损伤和功能障碍[13-15]。endprint

免疫学研究表明，CD4+T细胞是机体免疫系统的主要效应细胞，通过对抗原识别、处理、提呈等作用，在稳定机体的免疫平衡、维持机体免疫耐受等过程中起着至关重要的作用[16]。CD4+CD25+Tregs是近年研究发现的一类具有维持自身免疫稳定的T细胞亚群，它能够识别自身抗原并抑制自身反应性T细胞的免疫反应，在免疫自稳方面起着重要作用[17]。转录因子Foxp3对Treg细胞的分化成熟和功能维持都起着重要作用，研究证实，人体内的CD4+CD25+Tregs部分表达Foxp3，并且Foxp3+的这群细胞具有免疫抑制功能[18]。

研究发现，FOXP3的基因多态性与儿童/青春期AITD的发生风险具有正相关，因此FOXP3的基因在AITD存在高表达，而且对AITD的发生发展起到重要作用[19]。据研究报道，CD4+CD25+Tregs细胞亚群数量比正常儿童明显减少，这也说明AITD患者血液中存在明显的CD4+CD25+Tregs细胞亚群数量的降低[20]。本研究结果显示，三组外周血CD4+T的细胞数量比较，差异无统计学意义（P>0.05）；GD组外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T细胞的比率与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；HT组外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T细胞的比率明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），这说明了桥本甲状腺炎患者存在明显的免疫反应，而且这种反应明显比Graves病患者数量低。进一步研究显示，GD组和HT组外周血Foxp3 mRNA表达量均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）这也表明AITD发生后就会导致Foxp3 的表达。

AITD患者中的Graves病和桥本甲状腺炎血液中存在TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb水平的差异，而且Graves病和桥本甲状腺炎2种疾病中TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb水平也存在一定的差异，本研究结果显示，TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb水平与健康人存在差异，而且Graves病血液中的TT3、TT4水平高于桥本甲状腺炎患者，而TSH、TgAb、TPOAb水平明显低于桥本甲状腺炎患者，这也表明AITD患者的两种类型的疾病存在明显不同，而且AITD患者的两种类型的疾病中的TSH、TT3、TT4、TgAb、TPOAb水平与CD4+CD25+Foxp3+Tregs的相关性进行分析，可以显示CD4+CD25+Foxp3+Tregs与AITD的发生发展有明显关系。

综上所述，CD4+CD25+Foxp3+Tregs可能在AITD的发生发展进程中起着一定的作用，深入研究CD4+CD25+Foxp3+Tregs在AITD中的作用将有助于建立新的预防和治疗策略。

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（收稿日期：2017-04-12） （本文编辑：程旭然）endprint