水淹条件下秋华柳亚细胞中镉的分配特征

李 瑞,陈锦平,2,陈红纯,马文超,王 婷,周 翠,魏 虹,*

1 西南大学生命科学学院,三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室, 重庆 400715 2 广西农业科学院农业资源与环境研究所, 南宁 530007

三峡工程是当今世界最大的水利枢纽工程。竣工后在每年汛期(6—9月),水库水位保持在145 m,而在汛期后(10月开始)开始蓄水至水位175 m,从而形成了垂直落差最高达30 m的消落带[1]。消落带是水陆生态交错带的一种类型,其面积变化和水位涨落幅度大；水位涨落逆反自然洪枯规律,冬水夏陆[2],造成原有河流消落带植被消亡,在水库四周形成明显的裸露带,对环境造成严重影响[3-4]。三峡水库蓄水后被淹的土壤中重金属可从土壤中溶出或因土壤有机质分解而进入水体,严重影响库区的生态环境[5]。研究表明,镉是三峡库区表层土壤中污染最严重的重金属元素[6],具有生物活性的离子态Cd2+所占比例较高[7],易被植物所吸收,同时也极易进入食物链,从而对人体健康造成危害[8]。消落带土壤镉污染的治理成为人们关注的热点。植物修复是一种廉价、绿色的重金属修复技术,通过种植植物将土壤中的重金属吸收并富集到体内,达到降低土壤污染物浓度的目的[9]。在对三峡库区消落带进行植被重建的同时,联合重金属植物修复将达到事半功倍的效果[10]。

植物细胞应对重金属胁迫的最主要的机制之一就是通过把重金属元素从原生质体中转移到质外体部分(细胞壁和液泡)进行区室化,从而能够更好地保护对重金属毒性最敏感的原生质体部分[11]。植物耐受和富集重金属的能力与其在细胞和亚细胞水平上对重金属的区室化密切相关[12],因此对重金属亚细胞分布的研究有助于进一步理解植物对重金属的植物耐受和积累的机制[13]。

秋华柳(Salixvariegata)是三峡库区消落带优势灌木,可耐受长期水淹,是一种优良的护堤、护岸树种,可以广泛用于三峡库区消落带的植被恢复[14-15]。已有研究表明,秋华柳除对水淹有很强的适应能力,也表现出很好的镉耐受、镉转移能力及地上部分积累镉的能力[16]。曾成城等[10]发现,在水淹生境下,秋华柳对镉污染土壤仍具有较好的修复能力,预示着可将秋华柳用于镉污染的消落带土壤的植物修复中。张雯[17]在对秋华柳镉解毒机制的研究中发现,镉在细胞壁上的积累对其镉耐受性起着重要的作用。但在水淹条件下,秋华柳植株亚细胞中镉的分配特征是否会发生改变,从而影响秋华柳对镉的耐受和积累特性有待进一步研究。本试验以秋华柳扦插苗为研究对象,通过镉胁迫和模拟水淹,探究水淹是否会改变秋华柳根枝叶细胞壁对镉的积累特征,为秋华柳在消落带镉污染地区的应用提供更全面的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料的处理和培养

2015年10月在重庆市嘉陵江同兴街段河岸采集秋华柳枝条,超纯水冲洗后,剪成15 cm,茎径0.8—1 cm的小段扦插到花盆(上径13 cm×下径18 cm×高15 cm),每盆1株。每盆装入经自然风干去除杂质土壤2 kg,试验土壤的理化性质见表1。试验期间保持常规田间管理,适时浇水除草。2016年4月底选取生长基本一致无病虫害的秋华柳扦插苗随机分组。以镉胁迫和水分条件为考察因素设计双因素完全随机试验,具体设计见表2。按0、0.5、2、10 mg/kg设置4 个镉处理浓度。将CdCl2·2·5H2O 按浓度梯度配成水溶液后,均匀浇灌于盆土中,将渗出液反复回收浇灌,直到Cd2+与盆钵中土壤均匀混合。在水分条件控制上,一组进行常规供水管理(对照组),另一组则放入塑料盆(上径26 cm×下径19.5 cm×高17 cm)进行水淹处理(水淹组),各水淹盆里放置1个花盆,水淹组始终保持水位处于土壤表面以上5 cm处[18-19]。将所有盆栽试验用苗置于西南大学生态试验园的遮雨棚下(棚顶透明,四面敞开),适时补充水分,保证各处理组水分条件处于试验所设置的水平。于处理60 d后进行取样测试,每个处理15株,指标测定以随机抽取的5株苗木的平均值作为一个重复,共3个重复。

表1 土壤基本理化性质Table 1 The basic physico-chemical characteristics of soils

表2 试验设计Table 2 Experimental design

1.2 亚细胞组分分离方法

采用差速离心法分离不同的细胞组分：分别取根、茎和叶鲜样0.5 g,用预冷的匀浆液匀浆化6—8 mL,匀浆液组成为：蔗糖250 mmol/L,Tris-HCl(pH 7.5)50 mmol/L,二硫赤藓糖醇(C4H10O2S2)1.0 mmol/L。匀浆液用80 μm的尼龙布过滤,残渣即为细胞壁组分(I)；滤液以1500g离心力离心10 min(根则用2500g离心20 min),沉淀为质体组分(II)；上清液再以5000g离心20 min,沉淀为核组分(III)；上清再用15000g离心30 min,沉淀为线粒体组分(IV),上清则为可溶成分(V)[20]。通过镜检确认亚细胞组分符合分离要求,再将各组分进行微波消解后用ICP测定各组分的镉含量。

1.3 数据分析

利用统计分析软件SPSS 22.0 进行数据处理,运用单因素方差分析(One-way ANOVA)分析相同处理条件下植株根茎叶中不同亚细胞组分之间的差异,双因素方差分析(Two-way ANOVA)分析不同水分处理和不同镉浓度处理对秋华柳镉亚细胞分布的影响,Duncan多重比较(Duncan′s multiple range test)检验各处理之间的差异。

2 结果与分析

2.1 水淹对秋华柳根亚细胞组分镉含量的影响

由表3可知,非水淹情况下,在T0和T1镉处理浓度下,秋华柳根系细胞壁和质体中的镉含量显著高于其他组分,在T2和T3镉处理浓度下,细胞壁中的镉含量显著高于其他所有组分。在水淹条件下,在所有镉处理浓度下,细胞壁和质体中的镉含量均显著高于其他各组分,可溶成分中的镉含量次之,细胞核和线粒体组分中的镉含量始终处于较低水平。由此可见,细胞壁是秋华柳根细胞贮存镉元素最主要的部位。正常供水和水淹条件下,随着镉胁迫浓度的增加,秋华柳根细胞壁中的镉含量占总细胞镉含量的比例逐渐增加(正常供水分别为：24.0%、38.9%、39.1%和46.4%；水淹处理则依次是13.7%、43.1%、44.1%和45.0%)。

表3 水淹及不同镉处理浓度下秋华柳根亚细胞组分的镉含量/(μg/g鲜重)Table 3 Cd concentrations in subcellular fractions from the roots of Salix variegata under different Cd and water treatments

T0、T1、T2、T3分别为常规供水条件下0、0.5、2、10 mg/kg Cd2+组,WT0、WT1、WT2、WT3为水淹条件下的0、0.5、2、10 mg/kg Cd2+组。表中数值为平均值±标准误。同行不同小写字母表示相同处理条件下不同亚细胞组分之间镉含量差异显著(P<0.05)

从双因素方差分析结果(表4)可知,水淹处理和镉胁迫浓度对秋华柳根系细胞壁和质体中的镉含量有显著影响,二者的交互作用仅对质体中的镉含量有显著影响。图1显示,与常规供水相同镉处理组相比,水淹处理显著提高了秋华柳根系细胞壁和质体中的镉含量,对细胞核、线粒体以及可溶成分中的镉含量则无显著影响。不同镉胁迫浓度对细胞壁、质体和可溶成分和细胞核中的镉含量有显著影响,对线粒体中的镉含量无显著影响。

表4 水淹及不同镉处理浓度对秋华根亚细胞组分镉含量的方差分析结果Table 4 Effects on Cd concentrations in subcellular fractions from the roots of Salix variegata under different Cd and water treatments

*:P<0.05; ns:P>0.05

图1 不同处理下秋华柳根亚细胞组分的镉含量/(μg/g FW)Fig.1 Cd concentrations in subcellular fractions from the roots of Salix variegata under different treatmentsT0、T1、T2、T3分别为常规供水条件下0、0.5、2、10 mg/kg Cd2+组,WT0、WT1、WT2、WT3为水淹条件下的0、0.5、2、10 mg/kg Cd2+组;不同小写字母表示相同组分在不同处理组之间镉含量差异显著(P<0.05)

2.2 水淹对秋华柳枝亚细胞组分镉含量的影响

从表5可以看出,无论是水淹还是非水淹条件下,秋华柳萌枝细胞细胞壁中的镉含量处于较高水平,为枝细胞贮存镉元素最主要的部位。质体中镉含量次之,线粒体、细胞核和可溶成分中的镉含量则始终处于较低水平。正常供水和水淹条件下,随着镉胁迫浓度的增加,秋华柳萌枝细胞壁中的镉含量占总细胞镉含量的比例总体有所下降(正常供水分别为26.3%、44.8%、46.1%和66.2%,水淹条件下则依次是39.8%、41.3%、38.9%和50.5%)。

表5 水淹及不同镉处理浓度下秋华柳枝亚细胞组分的镉含量/(μg/g鲜重)Table 5 Cd concentrations in subcellular fractions from the shoots of Salix variegata under different Cd and water treatments

从双因素方差分析结果(表6)可知,水淹对秋华柳细胞壁中的镉含量有显著影响,二者交互对细胞壁和质体中的镉含量有显著影响。图2显示,水淹处理显著降低了高浓度处理(10 mg/kg)下秋华柳萌枝细胞壁中的镉含量,对质体、细胞核、线粒体以及可溶成分中的镉含量无显著影响。不同镉胁迫浓度对细胞壁、质体中的镉含量有显著影响,对其余3种组分中的镉含量无显著影响。

2.3 水淹对秋华柳叶亚细胞组分镉含量的影响

从表7可知,不管是水淹组还是非水淹组,秋华柳叶细胞细胞壁中的镉含量显著大于其他细胞亚组分中的镉含量,为叶细胞贮存镉元素最主要部位。正常供水和水淹条件下,随着镉胁迫浓度的增加,秋华柳叶细胞壁中的镉含量占总细胞镉含量的比例也总体有所下降(正常供水分别为47.21%、57.5%、49.7%和73.3%,水淹条件下则依次为43.9%、42.9%、45.9%和58.2%)。

表6 水淹及不同镉处理浓度对秋华柳萌枝亚细胞组分镉含量的方差分析Table 6 Effects on Cd concentrations in subcellular fractions from the shoots of Salix variegata under different Cd and water

图2 不同处理下秋华柳枝亚细胞组分的镉含量/(μg/g鲜重)Fig.2 Cd concentrations in subcellular fractions from the stems of Salix variegata under different treatments

表7 水淹及不同镉处理浓度下秋华柳叶亚细胞组分的镉含量/(μg/g鲜重)Table 7 Cd concentrations in subcellular fractions from the leaves of Salix variegata under different Cd and water treatments

由双因素方差分析结果(表8)和图3可知,水淹和二者交互作用对5种细胞组分的镉含量均没有显著影响。不同镉胁迫浓度对细胞壁、细胞核、质体以及可溶成分中的镉含量有显著影响,对线粒体中的镉含量无显著影响。

3 讨论

植物应对重金属胁迫的策略包括逃避和忍耐策略,即阻止重金属进入原生质体和将重金属区室化储存[21]。细胞壁作为重金属进入植物细胞的第一道屏障[22],可以通过形成胼胝质[23]和增厚细胞壁[24]来阻止重金属进入原生质体。组成细胞壁的多糖分子含有大量的负电基团,可以通过和金属阳离子发生各种反应将其固定于细胞壁中[25]。植物在遭受重金属胁迫后,还能够诱导细胞壁蛋白基因的高表达,产生相关细胞壁蛋白,参与细胞壁固定重金属离子[26],减少重金属离子的跨膜运输,从而减少进入原生质体重金属的数量,使细胞能够维持正常生理代谢[27]。当有大量重金属进入原生质体时,重金属会被转运至细胞壁进行储存[28-29]。因此,细胞壁是植物特别是对重金属具有较好耐受能力的植物应对重金属胁迫最主要细胞组分[30]。本研究结果发现,秋华柳根、萌枝和叶的细胞壁均是重金属镉的最主要富集部位,这与潘秀[31]和Ueno等[32]的研究结果相同。随着镉处理浓度的提高,秋华柳根、萌枝和叶细胞壁中的镉含量明显增加,帮助植株有效抵御了镉胁迫可能造成的伤害。

表8水淹及不同镉处理浓度对秋华柳叶亚细胞组分镉含量的方差分析

Table8EffectsonCdconcentrationsinsubcellularfractionsfromtheleavesofSalixvariegataunderdifferentCdandwatertreatments

处理TreatmentsⅠ(细胞壁)Ⅰ(Cellwall)Ⅱ(质体)Ⅱ(Plastids)Ⅲ(细胞核)Ⅲ(Cellnucleus)Ⅳ(线粒体)Ⅳ(Mitochondrion)Ⅴ(可溶成分)Ⅴ(Solublefractions)浓度处理Cdconcentrations***ns*水分处理Watertreatmentnsnsnsnsns水分×浓度Water×Concentrationsnsnsnsnsns

图3 不同处理下秋华柳叶细胞组分的镉含量/(μg/g鲜重)Fig.3 Cd concentrations in subcellular fractions from the leaves of Salix variegata under different treatments

研究证明,当较多的重金属阳离子通过质膜进入原生质体时,重金属大部分会被贮存在液泡中[33],可溶成分中低分子量的巯基可以与重金属结合[34],所以很多植物细胞的可溶成分是除细胞壁之外贮存重金属的主要部位[31-32,35]。但在本实验中,秋华柳细胞可溶成分中的镉含量远小于质体中的镉含量,细胞质体中的镉含量仅次于细胞壁中的镉含量,这与杨卫东等[36]和Ramos等[37]的研究结果相同。质体中的镉含量较高会降低植物叶绿素含量,导致植物叶片功能受损[36],但在本试验中发现秋华柳生长正常,没有出现叶片发黄等现象,说明秋华柳细胞对于镉胁迫的抗性较强。秋华柳的根、枝和叶的细胞核和线粒体组分中的镉含量则始终处于较低水平,以保持植物的正常生理活性[38],这与之前很多研究结果一致[31-32,35-37]。

有研究证明,亚细胞结构在植物对于重金属的耐受和富集能力上的作用不是一成不变的,重金属在亚细胞结构中的分布也易受到外源因素的影响,这甚至可能会改变植物对重金属胁迫的耐受和富集能力。周丽珍等[39]的研究表明,外加NaCl造成苋菜根、茎和叶细胞壁和细胞器中的镉含量总体显著下降,而胞液中的镉含量保持基本不变。由此可见,在外源NaCl影响下,苋菜细胞壁对镉的积累能力可能受到了较大影响。然而,也有相关研究表明通过施加其他因素可促进细胞壁对重金属的积累能力,Qiu等[40]的研究发现,磷的添加显著增加了卷心菜细胞壁中的镉含量,显著减少了细胞器中的镉含量,但随着磷浓度的增加对可溶成分中的镉含量没有显著影响,可以看出磷的添加提高了细胞壁对镉的富集能力。从本试验结果来看,水淹对秋华柳亚细胞镉的积累和富集能力的影响较小。水淹条件下,细胞壁仍是秋华柳根、枝、叶细胞中镉元素最主要富集部位,线粒体和细胞核中的镉含量一直处于较低水平。水淹对根细胞细胞壁中的镉含量占总细胞镉的比例影响不大,但水淹下枝、叶细胞壁中的镉含量占总细胞镉的比例总体上有所下降。水淹显著提高了根细胞壁中的镉含量,这是因为水淹提高了土壤中具有生物活性Cd2+的含量[41],而且镉从土壤中不断溶出至水中,根部Cd2+浓度较大[10],更容易被根吸收进入细胞,为了降低镉对原生质体的伤害,细胞壁需要固定更多的镉。但随着镉胁迫浓度的增加,仍会有较多的镉进入原生质体中,造成质体中的镉含量显著升高。水淹显著提高秋华柳根细胞壁和质体中的镉含量与根在水淹条件下的镉含量显著升高表现一致。水淹显著降低了高浓度处理(10 mg/kg)下萌枝细胞壁的镉含量,但对叶细胞壁镉含量没有显著影响。水淹导致重金属镉从地下部分转移到地上部分的数量减少,同时高浓度重金属镉胁迫会降低秋华柳萌枝细胞壁的渗透性[42],阻止重金属通过萌枝细胞壁。此外,水淹条件下秋华柳的萌枝形态和代谢途径都会发生变化[43],从而影响萌枝细胞壁多糖的重构[42],降低萌枝细胞壁的镉积累和贮存能力。

4 结论

水淹条件下,各处理组秋华柳根、枝和叶的细胞壁镉含量显著高于其他组分,是植株亚细胞中最主要的镉储存部位。细胞核和线粒体组分镉含量始终处于较低水平,以保证秋华柳植株的正常生长和生理活动。和正常供水相比,水淹对秋华柳亚细胞组分中镉的分配策略没有明显改变,可用于三峡消落带镉污染区域的植物修复。

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