苯并芘与肽聚糖体外协同刺激人皮脂腺细胞炎症因子表达及其意义

侯霄枭 曹 珂 胡婷婷 潘展砚 Christos C. Zouboulis 鞠 强

环境污染不但参与变态反应性皮肤病、皮肤肿瘤、皮肤老化等皮肤疾病发生，与痤疮之间也存在密切关联[1]。环境污染物二噁英诱导氯痤疮发生[2],吸烟可以引起的“吸烟者痤疮”[3]，最近也报道了北京大气污染可以增加寻常痤疮患者门诊就诊率[4]。但环境污染物诱发或者加重痤疮的机制目前仍有待探索。

痤疮是毛囊皮脂腺单位慢性炎症性疾病，毛囊内微生物如痤疮丙酸杆菌激活天然免疫Toll样受体2(TLR2)并导致促炎症因子尤其是IL-1α释放及随后的炎症级联反应发生是痤疮的重要启动和加重因素[5]，环境污染物中的主要成分如二噁英、多环芳香烃类化合物(PAHs)等通过芳香烃受体(AHR)影响人体健康。近年来在呼吸系统和肠道系统的研究发现，环境污染物介导的AHR和微生物诱导的TLRs之间存在协同作用，诱导炎症因子生成，参与呼吸道或者胃肠道炎症性疾病发生[6,7]。皮肤是保护人体与外界环境的屏障，毛囊中含有痤疮丙酸杆菌等大量微生物，我们推测环境污染物可能与毛囊内的微生物之间存在类似肠道与呼吸道的协同作用机制。因此我们体外研究环境污染物如PM2.5或者香烟中的主要代表性PAHs苯并芘体外和革兰氏阳性菌细菌壁成分肽聚糖(PGN)对SZ95人皮脂腺细胞炎症因子表达的影响，探讨环境污染物诱导或加重痤疮的发生机制。

1 实验器材与方法

1.1 药物准备与仪器 PGN(金黄色葡萄球细胞壁提取物，SigmaAldrich，美国)混悬于工作培养基中配置为2 mg/mL，分装后-20℃备用，使用时稀释为工作浓度20 μg/mL，苯并芘(SigmaAldrich，美国)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，配制成10-2mol/L，分装后-20℃备用，使用时用工作培养基配制至工作浓度10-5M/L，控制DMSO浓度≤1‰。

1.2 细胞培养 SZ95人皮脂腺细胞由德国Dessau临床医学中心皮肤科Zouboulis CC教授馈赠，传代在30-40代的细胞用于实验，细胞培养于Sebomed基础培养基中，添加10%胎牛血清、5 μg/L表皮生长因子、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。置于37℃，5% CO2培养箱中，每2天更换培养液1次。工作时新鲜配制工作培养基，添加2%胎牛血清，余同上。

1.3 RT-PCR法检测IL-1α,IL-1β及TNF-α mRNA表达的变化 细胞接种于(1×105个细胞/孔)24孔板，复3孔，次日加入PGN和苯并芘至工作浓度，0.1% DMSO作为对照组。作用2 h后，胰酶消化收集细胞，Trizol提取试剂提取总RNA，使用TAKARA试剂盒按照说明书获得cDNA，检测基因及引物序列见表1。设置GAPDH对照。RT-PCR检测反应条件：95℃预变性30 s；之后95℃变性，每次5 s，60℃退火30 s，循环45次，于60℃时收集数据。目的基因mRNA相对表达量采用ΔΔCT进行计算： ΔCT=CT目的基因-CTGAPDH，-ΔΔCT=ΔCTGAPDH-ΔCT目的基因， RQ(相对表达量)目的基因=2-ΔΔCT。

表1 基因及引物序列

1.4 ELISA法检测IL-1α,IL-1β及TNF-α的释放 SZ95细胞接种于24孔板中(1×105个细胞/孔)，次日PBS清洗后加入PGN,苯并芘至工作浓度，复3孔，0.1% DMSO作为对照组，24 h后收集细胞上清，4°C 3000 rpm离心后收集上清分装后-20°C存放待检测。检测时，按照IL-1α,IL-1β及TNF-α的ELISA试剂盒说明书操作分别进行操作，并设定空白对照孔，450 nm酶标仪检测吸光值。根据标准品检测数值制定标准曲线，得出线性公式，然后根据线性公式计算出相应的样本浓度，将计算出的样本浓度与对照组比较，观察其变化情况。

1.5 统计学方法 所得数据以均数±标准差表示，每组数据独立重复三次以上，采用Prism GraphPad(La Jolla, CA, USA)进行双因采方差统计分析，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001 ，采用Graphpad软件制图。

2 结果

2.1 PGN和苯并芘体外对皮脂腺细胞IL-1α分泌的影响 PGN刺激SZ95皮脂腺细胞，发现IL-1α mRNA及蛋白的表达明显增加(图1a,b)；苯并芘单独作用于皮脂腺细胞可见IL-1α mRNA的表达没有明显增加(图1a)，但其蛋白表达却明显上升(相较于空白对照组P<0.001)；而PGN和苯并芘联合刺激时发现苯并芘能协同增强PGN刺激皮脂腺细胞IL-1α的表达，与PGN单独作用组相比,mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.0001)表达均明显增加(图1a,b)。

2.2 PGN和苯并芘体外对皮脂腺细胞IL-1β分泌的影响 使用PGN刺激SZ95皮脂腺细胞，IL-1β mRNA (P<0.001)及蛋白(P<0.01)的表达增加；苯并芘单独作用于皮脂腺细胞可见IL-1β mRNA的表达没有明显增加但其蛋白表达有所增加(P<0.05)；同样，苯并芘的加入可以显著增强PGN诱导皮脂腺细胞IL-1β mRNA 和蛋白的表达(图2a,b)。

2.3 PGN和苯并芘对皮脂腺细胞产生TNF-α的影响 使用PGN刺激SZ95皮脂腺细胞，发现TNF-α mRNA(P<0.0001) 及蛋白(P<0.01)表达大量增加；苯并芘单独刺激皮脂腺细胞不能诱导TNF-α mRNA的表达增加但TNF-α蛋白表达却增加(P<0.01)；当用PGN和苯并芘联合刺激皮脂腺细胞时，TNF-α mRNA(图3a)的表达在PGN组和PGN+苯并芘组中没有明显差异。而PGN+苯并芘组中TNF-α蛋白的表达却明显高PGN单独作用组(图3b)。

图1 PGN和苯并芘体外对人SZ95皮脂腺细胞IL-1α分泌的影响：a: mRNA表达；b:蛋白表达图2 PGN和苯并芘体外对人SZ95皮脂腺细胞IL-1β分泌的影响：a:mRNA表达；b:蛋白表达

图3 PGN和苯并芘体外对人SZ95皮脂腺细胞TNF-α分泌的影响：a:mRNA表达；b:蛋白表达

3 讨论

氯痤疮、油痤疮、及吸烟者痤疮等痤疮亚型均证实了环境污染物与痤疮之间存在密切的关联。对于这些亚型机制的研究集中于环境污染物对毛囊干细胞分化紊乱上，二噁英诱导的氯痤疮、煤焦油诱导的油痤疮及香烟中苯并芘都是芳香烃受体(AhR)的配体。AhR被激活后，皮脂腺细胞的增殖、生长周期、凋亡、脂质合成等生物学功能发生改变，近年来先后发现二噁英和苯并芘都可能通过AhR信号通路诱导人皮脂腺细胞的异常分化[8,9]。苯并芘诱导皮脂腺细胞AhR依赖性产生炎症因子IL-6[9]。但环境污染物是否对寻常痤疮产生影响的研究较少。最近有研究报道北京大气污染物中的NO2, PM10和PM2.5浓度与皮脂分泌量、痤疮皮损数目及皮肤科痤疮患者门诊就诊率相关[4]，显示环境污染可能在寻常痤疮发病中起到重要作用。

痤疮的炎症反应是痤疮发病机制中的重要一环，促炎症因子IL-1 α等表达增加不仅能导致毛囊皮脂腺导管角化过度，也能够诱导级联产生更多的炎症因子如IL-6、TNF-α及GM-CSF[5,10]。痤疮丙酸杆菌是导致痤疮炎症发生的重要因素之一，PGN是革兰氏阳性细菌细菌壁，参与痤疮发生并常被用于体外痤疮炎症模型刺激物。本研究采用PGN刺激皮脂腺细胞构建皮脂腺细胞炎症模型，发现PGN对皮脂腺细胞有明显的促炎作用，分泌IL-1α，IL-1β,TNF-α等炎症因子，并在代表性环境污染物AhR配体苯并芘的协同作用下，炎症因子出现协同性增加，说明环境污染物可能加重了PGN诱导的炎症反应，这可能是痤疮发生或者加重的因素之一，AhR通路在肠道与呼吸道等研究上都证实了与TLR之间存在交联[11,12],因此我们推测苯并芘可能是作用于TLR2信号通路中的某一个靶位，进而增强PGN对TLR2信号通路的刺激。

总之，我们初步的研究显示环境污染物苯并芘与PGN协同刺激诱导了人皮脂腺细胞炎症因子的释放，显示污染物可能会通过增强或者诱发痤疮的炎症反应导致病程的加重。但苯并芘和PGN协同刺激皮脂腺细胞产生炎症因子的具体分子机制，仍有待进一步研究。

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