饲料中添加混合益生菌对幼参生长、消化酶活力和体壁营养组成的影响

包鹏云，李璐瑶，陈炜，孙静娴，左然涛，马悦欣

(大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023)

益生菌是活的、死的微生物细胞或其组分，一旦有饲料或养殖水供给时，可能通过增加宿主或其周围环境的微生物平衡使其饲料优化，达到提高宿主抗病力、耐受胁迫反应和生长性能的目的，从而有益于宿主健康水平[1]。

近年来，益生菌在刺参Apostichopus japonicus养殖中的应用已成为研究热点，饲料中添加外源枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis[2]和混合内源益生菌(梅奇酵母Metschnikowia sp.C14+芽孢杆菌Bacillus sp.BC26)[3]可提高幼参肠道异养细菌总数。单一内源细菌包括枯草芽孢杆菌[4]、马氏副球菌Paracoccus marcusii DB11[5]、假交替单胞菌Pseudoalteromonas elyakovii HS1[6]和希瓦氏菌Shewanella japonica HS7[6]，海洋酵母包括梅奇酵母C14[7]、仙人掌有孢汉逊酵母Hanseniaspora opuntiae C21[8]、红酵母Rhodotorula benthica D30[9]和红酵母Rhodotorula sp.C11[10]等均可促进幼参生长。芽孢杆菌BC26[11]、梅奇酵母C14[7]、仙人掌有孢汉逊酵母C21[8]、红酵母D30[9]和红酵母C11[12]等能提高幼参肠道消化酶活力。将内源混合菌 (乳酸菌L-2+芽孢杆菌K-3)加入养殖水体中，可提高幼参肠蛋白酶和淀粉酶等消化酶活力[13]。商品复合益生菌 (枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌Lactobacilli acidophilus+酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)可促进幼参生长，但对其消化酶活力和体壁营养组成无显著影响[14]。混合内源益生菌可提高幼参生长和消化酶活力[3]，而对其营养组成的影响尚未见报道。已有研究表明，由梅奇酵母C14[7]、红酵母H26[15]和芽孢杆菌BC26[11]组成的内源混合菌可促进幼参免疫反应并影响其抗氧化性能[16]。为此，本研究中，分析了这3株益生菌的混合菌对幼参生长、消化酶活力和体壁营养组成的影响，旨在为益生菌在刺参养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用健康幼参购买于大连某刺参养殖场。

1.2 方法

1.2.1 含菌饲料的制备及试验设计 益生菌梅奇酵母C14和芽孢杆菌BC26从刺参肠道分离获得，红酵母H26从刺参呼吸树分离获得。

将梅奇酵母C14菌株和红酵母H26菌株接种到酵母膏胨葡萄糖液体培养基，将芽孢杆菌BC26菌株接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基，于25℃下振荡培养16 h，将菌悬液离心，生理盐水重悬细胞，血球计数板计数。将菌液添加到幼参基础饲料，配方同文献 [17]，制备含C14菌株 (1×105cells/g)+H26菌株 (1×105cells/g)+BC26菌株(1×107cells/g)的饲料，菌株剂量同文献 [16]，试验饲料每天制备一次以保证菌株活力。

将幼参暂养 2周，选择体质量为 (0.54±0.06)g的幼参随机分配到6个盛过滤海水的塑料桶中，每桶200头，用含菌饲料和基础饲料分别投喂3桶幼参，每日投喂1次，投喂量为体质量的5%，每2 d换水1/2，吸底，用气石充气。试验期间，温度为16～24℃，pH为7.8～8.2，盐度为30。1.2.2 样品采集 幼参养殖第4周和第8周时，分别从每桶中随机取10头幼参，饥饿20 h使肠道内容物排空。用无菌过滤海水冲洗幼参体表，断尾解剖，将同一桶中幼参的肠道合并于离心管中，称量其质量，加入4倍体积的无菌生理盐水，用匀浆器匀浆后取一部分用于肠道细菌和酵母菌计数，剩余部分用液氮迅速冷冻后超低温 (-80℃)保存。

将保存于-80℃的肠道匀浆液在4℃下解冻，加入等量的生理盐水，用于肠道消化酶活力的测定。取足量的幼参进行解剖，去除内脏，保存体壁于冰箱 (-80℃)中，用于营养组成分析。

1.2.3 蛋白含量测定 采用考马斯亮蓝法[18]测定肠道匀浆液上清液中总蛋白含量。

1.2.4 幼参肠道微生物计数 将肠道匀浆液梯度稀释，取100 μL涂布于2216E琼脂平板 (异养细菌)、硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板(弧菌)和酵母膏胨葡萄糖琼脂平板 (酵母菌)，25℃下培养7 d，进行计数。

1.2.5 生长指标测定 分别在投喂前、第4周和第8周时对幼参体质量进行测定。从每个桶中随机取30头幼参，用纱布吸去体表水分后称量其体质量。特定生长率 (%/d)计算公式为

特定生长率(SGR)＝(ln Wt-ln W0)/t×100%。其中：W0和Wt分别为初始体质量和试验t天时的体质量 (g)；t为试验时间 (d)。

1.2.6 消化酶活力测定 采用南京建成科技有限公司试剂盒测定幼参肠道胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力，利用Epoch酶标仪进行测定，检测方法参照说明书 (将反应温度37℃ 修改为室温 20～24℃)。

1.2.7 体壁营养组成测定 分别采用凯氏定氮法(GB/T 5009.5—2010)、分光光度计法 (GB/T 9695.31—2008)、索氏抽提法 (GB/T 5009.6—2003)、马弗炉灼烧法 (GB/T 5009.4—2010)测定幼参体壁粗蛋白质、糖分、粗脂肪和灰分含量。

1.3 数据处理

试验数据采用平均值±标准差 (mean±S.D.)表示，并采用SPSS 16.0软件进行独立样本t检验，置信度为95%。

2 结果与分析

2.1 益生菌在幼参肠道的存活及对幼参肠道微生物数量的影响

从表1可见：养殖第4周和第8周时，幼参肠道芽孢杆菌BC26数量达到37.57×106CFU/g(肠道)和30.10×106CFU/g(肠道)，成为肠道优势细菌，分别占总异养细菌数量的76.94%和81.57%；酵母菌只有投喂的两株，其中梅奇酵母C14数量为(1.78～2.79)×105CFU/g(肠道)， 红酵母H26数量为(4.45～7.75)×103CFU/g(肠道)，梅奇酵母数量是红酵母H26的37～40倍；益生菌组幼参肠道异养细菌数量显著高于对照组 (P＜0.05)，但弧菌数量显著低于对照组 (P＜0.05)。

2.2 益生菌对幼参生长的影响

从图1可见，养殖第4周和8周时，益生菌组幼参特定生长率均显著高于对照组 (P＜0.05)。

2.3 益生菌对幼参消化酶的影响

从表2可见，养殖第4周和第8周时，与对照组相比，益生菌可显著提高幼参肠道胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活力 (P＜0.05)。

2.4 益生菌对幼参体壁营养组成的影响

从表3可见，养殖第4周和第8周时，益生菌组幼参体壁粗蛋白质和糖分含量均显著高于对照组(P＜0.05)；第8周时，益生菌组幼参体壁灰分含量显著低于对照组 (P＜0.05)；第4周和第8周时，益生菌组和对照组幼参体壁粗脂肪含量，以及第4周时两组幼参灰分含量均无显著性差异 (P＞0.05)。

表1 幼参肠道益生菌、异养细菌和弧菌数量Tab.1 Numbers of probotics，heterotrophic bacteria and vibrios in intestine of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus CFU/g intestine

表2 益生菌对幼参肠道消化酶活力的影响Tab.2 Effect of probiotics on the intestinal digestive enzyme activity of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

图1 益生菌对幼参特定生长率的影响Fig.1 Effect of mixed probiotics on specific growth rate of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

表3 益生菌对幼参体壁营养组成的影响 (干质量)Tab.3 Effect of probiotics on nutrient profile of body wall in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus(dry weight) w/%

3 讨论

3.1 益生菌对幼参肠道异养细菌和弧菌数量的影响

已有研究表明，给南非鲍 (壳长约50 mm)投喂含内源混合菌 (弧菌Vibrio midae SY9+隐球酵母Cryptococcus sp.SS1+汉逊德巴利酵母Debaryomyces hansenii AY1，各约107cells/g饲料)饲料3周后，其肠道中可培养益生菌数量为106～107CFU/g(肠道)[19]。给幼参投喂添加外源枯草芽孢杆菌(107CFU/g饲料)饲料8周，可提高其肠道异养细菌数量[2]；投喂添加外源干酵母 (1%和 2%)饲料8周，能显著降低幼参肠道内弧菌数，并显著提高其肠道中酵母菌数[20]；投喂添加内源混合菌(105cells/g梅奇酵母C14+107cells/g芽孢杆菌BC26)饲料4周，可提高幼参肠道异养细菌数量和酵母菌 (投喂菌)数量[3]，其中投喂细菌占异养细菌总数的90%，投喂酵母菌占可培养酵母菌总数的100%。与已有研究结果类似，本研究中给幼参投喂含混合益生菌饲料4周和8周后，3株益生菌成为幼参肠道优势菌，其数量为103～107CFU/g(肠道)，表明其在消化道中的存活能力很强，并能增加肠道可培养细菌数量，降低弧菌数量。本研究表明，饲料中补充益生菌可显著影响水生动物肠道中微生物数量。但3株菌是否能够在肠道中定植，可培养细菌数量的增加是否与其在肠道中定植有关有待于进一步研究。

3.2 益生菌对幼参生长的影响

某些益生菌作为饲料添加剂应用于幼参养殖中可促进其生长，如投喂添加0.8%商品复合益生菌制剂 (枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌+酿酒酵母，各种菌均大于106CFU/g)饲料8周[14]和投喂添加内源混合菌 (梅奇酵母C14+芽孢杆菌BC26)饲料4周[3]，均能显著提高幼参的特定生长率。与此类似，给南非鲍 (壳长分别为20、67 mm)投喂含混合菌 (弧菌SY9+隐球酵母SS1+汉逊德巴利酵母AY1，各约107cells/g)饲料8个月，其生长速率显著提高[21-22]。本研究中，饲料中添加一定浓度的混合内源益生菌4周、8周，显著提高了幼参特定生长率，与Macey等[21]及李明[3]的研究结果类似，这是因为益生菌能促进消化酶活力进而提高消化率。益生菌营养丰富，可能是动物的营养强化剂。

3.3 益生菌对幼参消化酶的影响

饲料中添加适宜浓度的益生菌有利于水生动物的消化过程。投喂添加混合益生菌 (弧菌SY9+隐球酵母SS1+汉逊德巴利酵母AY1，各约107cells/g)饲料8个月，南非鲍消化道肠区蛋白酶活力显著增加，这与鲍消化道肠区蛋白消化和吸收量的显著增加相关[21]。用含混合益生菌 (梅奇酵母C14+芽孢杆菌BC26)的饲料投喂幼参4周后，其肠道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均显著提高[3]。本试验中，投喂添加一定浓度的混合内源益生菌饲料(4周和8周)，显著提高了幼参肠道胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力，但幼参消化酶的提高是否与微生物合成的酶有关需要进一步研究，因为芽孢杆菌BC26[22]和红酵母H26均可分泌胞外蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶 (未发表资料)。

3.4 益生菌对幼参体壁营养组成的影响

某些益生菌可以在一定程度上影响鱼和虾的基本营养成分[23-26]。给虹鳟Oncorhynchus mykiss鱼苗投喂适宜浓度 (1.2×109～6.1×109CFU/g) 的商用益生菌 (枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌Bacullus licheniformis)63 d，鱼苗粗蛋白质含量显著增加[24]。给塞内加尔鰨Solea senegalensis幼鱼投喂含109CFU/g希瓦氏菌Shewanella sp.Pdp13的饲料8个月，其肌肉总蛋白质含量显著提高[26]。与Bagheri等[24]和 García de La Banda等[26]的研究结果类似，本研究结果表明，饲料中添加由梅奇酵母C14+红酵母H26+芽孢杆菌BC26组成的混合益生菌，可显著影响幼参体壁粗蛋白质、糖分和灰分含量。然而，给幼参投喂含复合益生菌 (枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌+酿酒酵母菌)的饲料，对其体壁营养组成无显著影响[14]。因此，混合益生菌 (梅奇酵母C14+红酵母H26+芽孢杆菌BC26)如何影响幼参体壁营养组成机制需要进一步研究。

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