乳酸菌发酵低糖桑葚复合果酱工艺优化及其风味成分分析

申光辉， 冯 孟， 张志清， 陈安均， 黎杉珊， 吴贺君

(四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014)

桑葚又名桑果、桑实、桑枣，富含白藜芦醇、花青素、黄酮等多种生物活性成分[1-4]，具有抗氧化[5-6]和解酒[7]等功能。中国桑葚资源丰富，但因其成熟期集中，皮薄，含水量较高，贮藏难度大，资源加工利用率低，导致其深加工产品多元化程度不高。

利用益生乳酸菌发酵果蔬产生的香气物质来改善果蔬产品的风味，并产生新的功能活性成分，提高其营养保健价值[8-11]，已成为国内外果蔬深加工研究的热点之一。如利用乳酸菌发酵制得胡萝卜汁[12]、番茄汁[13]、石榴汁[14]、南瓜汁[15]和樱桃果泥[16]等功能性发酵果蔬汁(浆)产品。利用植物乳杆菌R23进行发酵，使枇杷果汁增加了以醇类和酸类为主的6种挥发性特征风味物质[17]。利用嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌发酵，分别增加了西瓜汁中酸类挥发性风味物质和酮类挥发性风味物质[18]。接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵龙眼果浆，可增加果浆醇类、醛类、酯类、酮类和酸类等18种挥发性风味物质[19]。

果酱是各种不耐贮藏浆果的主要加工产品[20]。目前，中国桑葚主要采用传统果酱加工方式，其含糖量高(≥60%)[21]，产品种类单一，风味寡淡，无法满足市场需求。因此，低糖桑葚果酱加工新工艺研究对其产业的可持续发展具有重要意义。多数研究主要通过添加胡萝卜、番茄[22]或红枣[21]等果蔬原料，提高低糖桑葚果酱的口感风味和营养价值。近年来，乳酸菌发酵工艺逐渐被应用于脐橙[23]、蓝靛果[24]及桑葚[25]等果酱的加工中，以改善产品风味。但关于乳酸菌发酵对桑葚果酱风味物质成分影响的报道较少。本研究拟以桑葚为原材料，以富含VC、矿物质等多种营养元素的番茄和胡萝卜为辅料，通过乳酸菌发酵改善低糖桑葚复合果酱的产品风味，采用离子色谱法测定发酵果酱有机酸组成及含量，顶空固相微萃取-气相色谱-串联质谱法(SPME-GC-MS)分析乳酸菌发酵对桑葚果酱挥发性物质的影响，以期为桑葚果酱制备工艺的优化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 桑椹品种为无核大十果桑，采自四川德昌县，番茄和胡萝卜均购自本地农贸市场，蔗糖购自本地超市，脱脂乳粉购自伊利乳业有限责任公司，柠檬酸、海藻酸钠、黄原胶、低甲氧基果胶(LMP)和氯化钙(食品级)均购自河南千志商贸有限公司，伊仕特酸奶发酵剂(主要菌种为嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌)购自湖北安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 培养基与试剂 MRS液体培养基：蛋白胨10.00 g，牛肉膏10.00 g，酵母膏5.00 g，磷酸氢二钾2.00 g，柠檬酸二铵2.00 g，乙酸钠5.00 g，葡萄糖20.00 g，吐温-80 1 ml，MgSO4·7H2O 0.50 g，MnSO40.25 g，蒸馏水1 L，pH 6.2～6.4，121 ℃灭菌20 min。乳酸、乙酸、甲酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、柠檬酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 采用仪器设备主要有：100 型胶体磨(郑州玉祥公司产品)、WZS-1型阿贝折光仪(上海光学仪器厂产品)、pHS-320型酸度计(成都世纪方舟公司产品)、ZWY-2102C型恒温摇床(上海智城分析仪器公司产品)、TA-Xplus型质构仪(超技仪器公司产品)、ICS-1100型离子色谱仪(Thermo公司产品)、7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪(Agilent公司产品)、50/30 μm DVB/CAR/PDMS型顶空固相微萃取头(Supelco公司产品)。

1.2 方法

1.2.1 果浆制备 挑选无机械损伤、无腐烂、无病虫害的新鲜桑葚、番茄和胡萝卜，用水漂洗干净，分别蒸汽漂烫软化。桑葚漂烫3 min后打浆，番茄十字形切4块漂烫4 min后打浆，胡萝卜切0.5 cm厚片漂烫8 min，按0.5 ml/g加水打浆。传统果酱大都以单一原料果肉进行加工，为了使得果酱口感更丰富并提高果酱营养价值，对果酱进行多种原料复配。根据混料试验结果，将各原料果浆按质量比为桑葚∶番茄∶胡萝卜=7.3∶1.0∶1.7混匀，100 ℃沸水浴杀菌20 min，冷却备用。

1.2.2 发酵种子液制备 菌种活化：将灭菌MRS培养液冷却至室温，接种乳酸菌菌剂，37 ℃、140 r/min恒温振荡培养，连续传3代，直到活菌数大于等于 1×108CFU/ml。

种子液制备：分别配制复合果浆添加量为25%、50%、75%、100%的MRS培养基，按复合果浆添加量由低到高进行传代培养，每代均在37 ℃、140 r/min条件下恒温振荡培养36 h，使发酵菌种逐步适应复合果浆的培养条件，每代测得活菌数均达到 1×108CFU/ml以上，即得发酵种子液。

1.2.3 乳酸菌发酵条件优化 根据预试验结果，采用L9(34)正交试验，以感官评价为指标，对接种量、发酵时间、蔗糖添加量、脱脂乳粉添加量4个主要影响因素进行优化，试验因素及水平见表1。将制备好的发酵种子液接种于杀菌复合果浆中，37 ℃静置发酵。按表2的评分标准对发酵果浆进行感官评价。

表1复合果浆乳酸菌发酵L9(34)正交试验因素水平表

Table1FactorsandlevelsofL9(34)orthogonalexperimentoffruitpulpfermentedbylacticacidbacteria

水平接种量(CFU/ml)发酵时间(h)蔗糖添加量(%)脱脂乳粉添加量(%)11×104128321×1051610531×10620127

表2发酵果浆感官评分标准

Table2Sensoryevaluationcriteriaoffermentedfruitpulp

评分项目 评分标准分值口感(35分)口感纯正,桑葚味浓,无异味26～35口感较纯正,桑葚味较淡,少有异味16～25风味不正,无桑葚味,有异味0～15气味(40分)具有桑葚特有香气和良好酵香味,香气浓郁31～40具有桑葚独特香气和较为良好的酵香味,香气较淡16～30不具有桑葚香气,有异味,较差的酵香味0～15色泽(25分)色泽呈深紫色或紫色,颜色均匀一致21～25色泽呈淡紫色,颜色基本均匀一致16～20不表现紫色,颜色不均匀0～15

1.2.4 果酱调配浓缩工艺优化 依据预试验结果，采用U6(6×32×2)均匀试验设计，以果酱感官品质、凝胶强度和黏度为指标，对蔗糖添加量、果浆pH值、复合增稠剂添加量和CaCl2添加量4个主要因素进行优化，试验因素水平见表3。将发酵复合果浆调整pH后倒入不锈钢锅中进行预浓缩，分批添加糖浆，至可溶性固形物含量为40%左右时加入复合增稠剂(根据感官评价和质构获得的最佳增稠剂配比为：低甲氧基果胶∶黄原胶=1∶1)和凝固剂CaCl2，搅拌均匀获得发酵低糖桑葚复合果酱。根据果酱感官要求[26]，并结合乳酸菌发酵果酱风味特点制定果酱感官评价标准(表4)。由10名专业人员组成感官评价小组进行感官评价。凝胶强度、黏度采用质构仪测定，选用A/BE探头，d40盘状活塞，下降速度1 mm/s，测试速度1 mm/s，上升速度1 mm/s，触发力Auto-5 g，测试距离20 mm，记录速度200 pps。

表3果酱调配浓缩U6(6×32×2)均匀试验因素水平表

Table3FactorsandlevelsofU6(6×32×2)uniformexperimentintheprocessofjamconcentration

水平蔗糖添加量(%)果浆pH值复合增稠剂添加量(%)CaCl2添加量(%)15.003.200.500.02210.003.700.600.04315.004.200.70420.00525.00630.00

表4发酵低糖桑葚复合果酱的感官评定标准

Table4Sensoryevaluationcriteriaoffermentedlow-sugarcomplexmulberryjam

评分项目 评分标准分值气味(15分)具有桑葚果香和良好的酵香味,香气浓郁14～15具有桑葚果香和较为良好的酵香味,香气稍淡11～13无桑葚果香,有异味0～10色泽(15分)色泽自然明亮,光泽度好,呈紫色或紫红色14～15色泽较明亮,光泽度较差,淡紫红色11～13色泽灰暗,光泽度差,非紫红色0～10口感(30分)酸甜适中,果味浓郁26～30略偏酸或偏甜,果味较淡16～25酸甜比例不协调有异味0～15质构(30分)凝胶良好,无流散,无分层析水26～30基本形成凝胶,流散轻微,分层析水较少16～25未形成凝胶,流散缓慢,分层析水较多0～15涂抹性(10分)易涂抹,涂层均匀光滑9～10较易涂抹,涂层均匀但不光滑6～8难涂抹,涂层不均匀,不连贯0～5

1.2.5 果酱有机酸测定 采用离子色谱仪测定。色谱条件：IonPac AS18 (4 mm×250 mm)阴离子交换分析柱，AG18保护柱(4 mm×50 mm)。KOH淋洗液梯度洗脱条件：0～13 min 2 mmol/L，13～30 min 2～45 mmol/L，30～45 min 45 mmol/L，45～50 min 45～2 mmol/L；淋洗液流速1 ml/min；进样体积25 μl，色谱池温度35 ℃，柱温30 ℃，抑制电流112.5 mA。样品用纯水稀释100倍，过SPE-RP柱和SPE-Ag柱，去掉3 ml初滤液后经0.22 μm滤膜过滤，进样分析，峰面积按外标法进行定量。

1.2.6 果酱挥发性风味物质分析 为考察乳酸菌发酵对桑葚复合果酱挥发性成分的影响，采用顶空固相微萃取-气相色谱-串联质谱法测定发酵低糖复合果酱的挥发性物质[27]，以未发酵低糖桑葚果酱为对照进行分析。顶空固相微萃取：取5 g果酱于15 ml采样瓶中，加入NaCl调整其质量浓度为0.1 g/ml，超声10 min，插入装有萃取纤维头的手动进样器，60 ℃萃取30 min，快速移出萃取头并插入气相色谱进样口，250 ℃热解析3 min进样。色谱条件：HP-5MS (30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱，进样口温度250 ℃，He载气流量1 ml/min，不分流。程序升温：起始温度40 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min升温至190 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min。质谱条件：电子轰击电离(EI)源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，质量扫描的质荷比范围为33～550，接口温度为250 ℃。利用GC-MS工作站的NIST 11.L标准图库对采集到的质谱图进行检索，根据匹配度来确定未知化合物，当相似度(SI)>80%时定性为对应化合物，采用峰面积归一化法计算各成分相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵工艺条件优化

单因素试验结果表明，乳酸菌接种量、发酵时间、蔗糖添加量和脱脂乳粉添加量4个发酵参数对乳酸菌发酵桑葚复合果浆的感官品质影响较大。表5和表6显示，各影响因素的主次顺序为：接种量>脱脂乳粉添加量>发酵时间>蔗糖添加量。接种量对发酵果浆感官分值具有显著影响，而发酵时间、蔗糖添加量和脱脂乳粉添加量对发酵果浆感官分值的影响不显著(表6)。采用L9(34)正交试验确定最佳发酵条件，接种量1×105CFU/ml、发酵时间20 h、蔗糖添加量8%、脱脂乳粉添加量5%，在此条件下进行验证发酵试验，所得发酵果浆感官评分为83.6，与试验组评分差异不大。

表5乳酸菌发酵果浆L9(34)正交试验设计及结果

Table5Orthogonalexperimentdesignandresultsoffruitpulpfermentedbylacticacidbacteria

试验号接种量发酵时间蔗糖添加量脱脂乳粉添加量感官分值Ⅰ111174.6±1.0Ⅱ122277.5±0.6Ⅲ133378.9±1.4Ⅳ212379.0±3.1Ⅴ223182.1±0.7Ⅵ231285.1±0.1Ⅶ313379.2±1.4Ⅷ321273.2±0.8Ⅸ332177.4±2.5k177.077.677.678.0k282.177.677.980.6k376.680.580.177.0Rj5.52.92.53.6

k1、k2、k3分别为各因素1水平、2水平、3水平的感官分值的平均值。Rj为极差。1、2、3见表1。

表6乳酸菌发酵果浆正交试验方差分析结果

Table6Analysisofvarianceoforthogonalexperimentoffruitpulpfermentedbylacticacidbacteria

变异来源 平方和自由度均方F值P值接种量111.8233255.91177.58070.0118发酵时间33.0700216.53502.24190.1622蔗糖添加量21.0033210.50171.42380.2902脱脂乳粉添加量40.7233220.36172.76070.1162误差66.380097.3756

2.2 果酱调配浓缩工艺优化

发酵低糖桑葚复合果酱制作的关键工艺在于蔗糖用量、初始pH、复合增稠剂添加量和CaCl2添加量。蔗糖的加入会在浓缩过程中加速果酱凝结，同时增加渗透压，可起到一定的防腐作用，但蔗糖添加过多则会掩盖原料果汁风味，导致果酱酸甜比例不适，风味较淡，蔗糖添加过少，则果酱凝结缓慢，达不到果酱在甜度上的需求。低糖果酱中蔗糖的添加量低(质量分数<50%)，影响果酱的凝胶效果，通过添加适量的增稠剂和凝固剂，在一定pH条件下才可以形成凝胶状态良好、口感细腻的果酱。因此，采用U6(6×32×2)均匀设计确定最佳调配浓缩条件(表7)。

表7U6(6×32×2)均匀试验设计及结果

Table7Experimentaldesignandresultsoftheuniformexperiment

试验号X1X2X3X4Y1Y2(g)Y3(g·s)Ⅰ112277.5212.5-196.5Ⅱ223281.6225.8-216.5Ⅲ331277.8240.3-195.2Ⅳ413181.3283.2-210.3Ⅴ521183.8293.8-218.3Ⅵ632176.3276.3-204.6

X1：蔗糖添加量；X2：果浆初始pH值；X3：复合增稠剂添加量；X4：CaCl2添加量；Y1：感官评分；Y2：凝胶强度；Y3：黏聚性。1、2、3见表3。

分别以感官评分(Y1)、凝胶强度(Y2)及黏聚性(Y3)为优化指标，采用DPS 7.05软件进行二次多项式逐步回归分析，建立的回归方程及检验结果分别为：

0.142 9X1X3+27.457 0X1X4

(1)

X1为蔗糖添加量，X2为果浆初始pH值，X3为复合增稠剂添加量，X4为CaCl2添加量。方程相关系数r=0.999 6，F=298.280 0，显著水平P=0.043 4，剩余标准差S=0.189 7，调整相关系数ra=0.997 9，Durbin-Watson统计量d=2.70。

(2)

方程相关系数r=0.999 9，F=1 533.100 0，显著水平P=0.019 2，剩余标准差S=0.958 0，调整相关系数ra=0.999 6，Durbin-Watson统计量d=2.66。

(3)

方程相关系数r=0.999 9，F=2 963.140 0，显著水平P=0.013 8，剩余标准差S=0.202 1，调整相关系数ra=0.999 8，Durbin-Watson统计量d=1.83。

上述结果表明，所得3个回归方程的P值均小于0.05，Durbin-Watson统计量d均为2.00左右，拟合结果较好。由各变量显著性检验P值大小(表8)可知，各因素对样品感官评分、凝胶强度及黏聚性的影响均存在交互作用(P<0.05)。

表8二次多项式逐步回归结果

Table8Theresultsofquadraticpolynomialstepwiseregression

因变量影响因子偏相关系数t值P值感官评分X20.999123.86400.0018X2X2-0.999326.23150.0015X1X3-0.98445.59020.0305X1X40.997714.85690.0045凝胶强度X3-0.99388.93040.0123X2X20.998317.10420.0034X4X4-0.999848.59790.0004X2X40.998820.12110.0025黏聚性X30.999973.75210.0002X3X3-0.999854.42860.0003X4X40.999986.21080.0001X3X4-0.999972.49870.0002

X1、X2、X3、X4见表7注。

根据回归方程(1)、(2)、(3)进行寻优计算，获得感官评分、凝胶强度和黏聚性的最优参数。表9显示，以不同指标所建立的回归方程得到的寻优结果不完全相同，为验证3个方程可靠性，分别对3组最优参数组合进行验证试验(表10)。3个不同回归方程所得最优参数条件下制备的样品感官评分、凝胶强度、黏聚性指标实测值与方程预测值相对误差较小，表明3个方程的预测能力较好。同时，以感官评分优化获得的最佳参数所制备的样品，其凝胶强度和黏聚性均接近于其他2组优化条件下制备的产品，表明采用感官评价凝胶强度和黏聚性与质构仪器测定结果差异不大。但以凝胶强度、黏聚性为优化指标所得最优条件制备的果酱的感官评分略低，这可能是因为酸甜度对果酱口感的影响较大，而质构仪无法评价样品的酸甜度。因此，综合感官评价、凝胶强度和黏聚性所得的优化条件，最终确定调配浓缩的最优组合为：蔗糖添加量28.90%，初始pH值3.8，增稠剂添加量0.50%，氯化钙添加量0.04%。该条件下制备的发酵低糖桑葚复合果酱呈明亮的紫红色，具有桑葚清爽的果香，香气协调，酸甜适中，酱体均匀细腻，凝胶良好，易涂抹，涂层均匀光滑，流散适宜，无分层析水现象，口感风味俱佳。

表9二次多项式逐步回归浓缩条件寻优结果

Table9Theconcentrationconditionsobtainedbyquadraticpolynomialstepwiseregressionmodel

X1、X2、X3、X4、Y1、Y2、Y3见表7注。

表103组最优参数组合验证试验结果

Table10Theactualvaluesofjampreparedwiththreedifferentconcentrationconditions

最优参数组合X1X2X3X4实测值Y1Y2Y328.903.800.510.0494.70284.00-197.6027.703.500.500.0285.60289.00-203.5029.204.200.530.0483.20279.00-190.00

X1、X2、X3、X4、Y1、Y2、Y3见表7注。

2.3 有机酸分析

8种有机酸混标色谱图如图1显示，有机酸是果酱重要风味和特征成分。表11显示，从果酱样品中共检出7种主要有机酸，与未发酵果酱相比，乳酸菌发酵果酱中乳酸含量、乙酸含量和柠檬酸含量增加，琥珀酸含量、草酸含量和苹果酸含量降低。因此，通过乳酸菌发酵增加了果酱中乳酸、乙酸及柠檬酸含量，特别是乳酸和柠檬酸含量的增加，改善了果酱感官品质，赋予发酵果酱厚重的口感。

1：乳酸；2：乙酸；3：甲酸；4：琥珀酸；5：苹果酸；6：酒石酸；7：草酸；8：柠檬酸。图1 8种有机酸标样离子色谱图Fig.1 Ion chromatogram of eight organic acids

2.4 挥发性风味物质分析

表12显示，2种桑葚果酱样品中总共鉴定出13种挥发性成分，其中酯类8种，烯类4种，脂肪酸1种。其中乳酸菌发酵果酱中检出11种挥发性成分，占总峰面积的40.61%，酯类7种，占36.42%，烯类3种，占1.98%，脂肪酸类1种，占2.21%。未发酵果酱中检出5种挥发性成分，占总峰面积的30.41%，酯类3种，占27.65%，烯类2种，占2.76%。

发酵低糖桑葚复合果酱风味物质主要来源于原料和乳酸菌发酵代谢产物，即浓缩过程中新产生的物质。通过对发酵果酱和未发酵果酱的挥发性物质进行分析对比，发现两者有3种共有的挥发性物质，其中发酵果酱右旋萜二烯和反-9-十八烯酸甲酯的相对含量均低于未发酵果酱，可能是因为其在发酵过程中的相关发酵底物被乳酸菌代谢利用。发酵果酱与未发酵果酱相比，增加了8种挥发性物质，包括5种酯类，2种烯类和1种脂肪酸，这些化合物赋予了桑葚发酵果酱独特的风味和香气。酯类化合物是发酵果蔬中一种很重要的挥发性风味物质，具有特殊的香味，同时酯类物质的阈值一般较低，对整个体系风味的贡献很大[19]。因此，酯类物质是乳酸菌发酵低糖桑葚复合果酱风味的重要成分。

3 结 论

本研究获得了乳酸菌发酵低糖桑葚复合果酱的最佳工艺：乳酸菌接种量 1×105CFU/ml，蔗糖添加量8.00%，脱脂乳粉添加量5.00%，发酵20 h,调整pH为3.8，蔗糖添加量28.90%，增稠剂(低甲氧基果胶∶黄原胶=1∶1)添加量0.50%，CaCl2添加量0.04%，进行浓缩，获得的发酵低糖桑葚复合果酱产品呈明亮的紫红色，具有桑葚果香和乳酸发酵芳香气味，组织细腻，酸甜适中，稳定性好，其总糖含量(<42.00%)远低于传统果酱(含糖量≥65.00%)，符合当前消费者对食品三低(低糖、低盐、低脂肪)的要求。利用乳酸菌对复合果浆进行发酵，增加了低糖桑葚复合果酱中乳酸含量、乙酸含量、柠檬酸含量以及挥发性物质种类和含量，尤其是酯类香气成分，改善了产品的风味。

表11发酵低糖桑葚复合果酱与未发酵果酱有机酸含量的比较

Table11Comparisonoforganicacidscontentinfermentedlow-sugarcomplexmulberryjamandunfermentedjam

样品 有机酸含量(mg/g)乳酸乙酸甲酸琥珀酸苹果酸酒石酸草酸柠檬酸发酵果酱1.937±0.0050.162±0.0110.023±0.0030.984±0.0110.282±0.005-0.065±0.00616.400±0.256未发酵果酱0.083±0.0020.014±0.0010.029±0.0023.165±0.0180.704±0.008-0.088±0.00314.709±0.312

-：未检测出化合物。

表12乳酸菌发酵对桑葚果酱挥发性成分的影响

Table12Effectoflacticacidbacteriafermentationonvolatilecomponentsofmulberryjam

编号保留时间(min)CAS号化合物名称相对含量(%)发酵果酱未发酵果酱112.513387-41-5桧烯0.27-212.5228634-89-1β-侧柏烯-0.43314.445989-27-5右旋萜二烯1.582.33415.4799-85-4萜品烯0.13-537.555129-60-214-甲基十五酸甲酯6.13-637.56112-39-0棕榈酸甲酯-5.62739.521731-92-6十七酸甲酯0.20-840.60112-63-0亚油酸甲酯8.66-940.691937-62-8反-9-十八烯酸甲酯13.9419.291041.05112-61-8硬脂酸甲酯2.892.741141.4260-33-3亚油酸2.21-1241.871000336-44-09,11-十八碳二烯酸甲酯1.19-1343.431120-28-1花生酸甲酯3.41-

-：未检测出化合物。

在果蔬汁发酵中，不同的乳酸菌菌种对果蔬汁的适应性及其对原料功能性成分的影响不同[15,18,28]。本研究仅采用市售乳酸菌发酵菌剂进行试验，证实了乳酸菌发酵可通过产生乳酸等有机酸以及酯类等香气成分改善桑葚低糖果酱的风味，但仍需进一步筛选适应性更强的发酵菌株，并分析发酵对桑葚功能性活性成分及其有效性的影响。

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