佛手与香橼、柠檬、椪柑挥发油的成分及抑菌和清除DPPH自由基作用比较

徐丽珊， 王利枝， 江震宇

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

佛手(CitrusmedicaL. Var.sarcodactylisSwingle)为芸香科柑橘属植物，是香橼的变种，与柠檬、椪柑等有较近的亲缘关系，主要分布在我国的浙江、四川、广东、广西和福建等地.近些年的研究表明，佛手不仅具有较高的欣赏价值，还具有较高的药用价值，富含挥发油[1]、黄酮类[2]、多糖[3-4]、维生素和矿质元素[5]等成分，具有抗氧化[6]、抗癌[7]、抗炎[8]、抑菌[9]、促胰岛素分泌[10]及免疫调节[11]等生物活性.佛手果皮挥发油的香味独特，还具有止咳平喘、疏肝理气的功效[12]，且其抗氧化[6]、抑菌[13]、抗抑郁[14]和抗肿瘤[15]等活性已有文献报道.

香橼(CitrusmedicaL.)、柠檬(Citruslimon(L.) Burm. f.)和椪柑(CitrusreticulataBlanco cv. Ponkan)也属于柑橘属植物，其果实均含有气味清新怡人的挥发油，从佛手、香橼、柠檬和椪柑果皮中提取的挥发油是天然香料香精中的一大类.不同品种的柑橘类果皮挥发油其组成成分、香气特征和功效上往往存在一定的差别，而佛手挥发油的主要成分与其他柑橘类果皮挥发油有哪些异同，是否具有类似的抗氧化和抗菌作用，目前还未见报道.黑曲霉和青霉是最常见的食物致腐真菌，而挥发油清除DPPH·能力是评价其抗氧化能力的最常用指标，因此，本研究同时选取佛手及与佛手亲缘关系较为接近的香橼、柠檬、椪柑品种，比较佛手挥发油与这3种挥发油化学成分的不同及对黑曲霉和青霉菌的抑制和清除DPPH·活性能力的差异，进一步推动佛手挥发油在食品保鲜剂、香料和医用等方面的利用.

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

材料：佛手、柠檬、椪柑和香橼，均产自浙江省金华市；黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉(Penicillium) 由浙江师范大学微生物学实验室提供； 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)购自美国Sigma公司.

仪器：岛津UV-2550 紫外分光光度计；岛津GCMS-QP2010气质联用仪；Buchi R-210旋转蒸发仪；BT224S型电子天平；MLS-3750型高压蒸汽灭菌锅；SW-CJ-1F型超净工作台；SPX-90B型恒温生化培养箱.

1.2 实验方法

1.2.1 材料处理

佛手：取新鲜佛手果，准确称量切块，以水作溶剂按照1∶3的料液比加水，打成浆状.

香橼、柠檬和椪柑：取新鲜果子，剥皮除去果囊，准确称量果皮切块，以水作溶剂按照1∶3的料液比加水，打成浆状.

1.2.2 精油的提取

分别取600 mL处理后的植物浆液，装入1 L的提取瓶内，采用水蒸气蒸馏法蒸馏2 h.停止加热后，待提取器中自然分层时，取出上层油状物质，加入适量无水硫酸钠，静止过夜，以除去挥发油中残余水分.制得澄清挥发油液体，置于4 ℃冰箱避光冷藏待用.按式(1)计算挥发油得率.

(1)

1.2.3 挥发油气相色谱-质谱的分析条件

色谱柱条件：DB-1弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氮气，程序升温条件：初始温度为40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升至200 ℃，维持10 min.进样口温度230 ℃，检测器温度250 ℃，分流比为100∶1，进样量1 μL.

质谱条件：电离源为EI，电子能量70 eV；质量扫描范围30～600 amu，电子倍增器电压1.5 kV，发射电流0.5 mA.

1.2.4 抑菌活性测定

以溶剂无水乙醇为空白对照，采用生长速率法[16]测定4种挥发油对黑曲霉和青霉的抑菌活性.并按式(2)计算抑菌率.

(2)

式(2)中：d0为对照组生长圈直径；d1为实验组生长圈直径；d2为菌饼直径.

1.2.5 清除DPPH·能力测定[17]

取2 mL样品液和2 mL DPPH·溶液(0.2 mol/L)于10 mL试管，混匀，避光静置30 min，测517 nm 处吸光度值(Ai).以溶剂代替DPPH·溶液，同样操作，测吸光度值(Aj)；以溶剂代替样品液，同样操作，测吸光度值(Ac).根据式(3)计算清除率.

(3)

1.2.6 统计学处理

所有实验重复3次以上，数据采用SPSS软件和Design-Expert 8.05软件分析，以平均值±标准差表示，P<0.01为差异极显著，0.01≤P≤0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著.

2 结 果

2.1 挥发油得率

用水蒸气蒸馏法提取得到4 种呈澄清透明的淡黄色挥发油，挥发油得率由高到低的顺序为椪柑>柠檬>佛手>香橼，得率依次为(2.14±0.14)%，(1.42±0.19)%，(0.81±0.03)%，(0.18±0.03)%.柑橘类精油主要存在于果实外果皮的细小分泌腺中，而这4种果实的结构不同，佛手没有果囊，香橼果皮中的白色内皮相对较多，椪柑和柠檬果皮中外果皮所占比例大于内果皮，这可能也是佛手挥发油得率低于椪柑和柠檬挥发油的原因.

2.2 挥发油成分类别及GC含量

4 种挥发油的GC-MS分析结果见图1～图4.结果显示，佛手挥发油共分出40 个色谱峰，香橼挥发油共分出44 个色谱峰，柠檬挥发油共分出36 个色谱峰，椪柑挥发油共分出27 个色谱峰.通过与数据库标准图谱进行检索，选取匹配度最高(>90)的图谱作为该组分物质，采用峰面积归一化法计算各组分物质的相对含量，各组分化合物名称、分子式和相对含量如表1所示.

图1 佛手挥发油总离子流色谱图

图2 香橼挥发油总离子流色谱图

图3 柠檬挥发油总离子流色谱图

图4 椪柑挥发油总离子流色谱图

由表1可知，佛手挥发油鉴定出40 个化合物，成分主要为烯烃类、醇类和醛类，主要化合物(相对面积>1%)有11 种，占总峰面积的93.77%.香橼挥发油鉴定出44 个化合物，成分主要为烯烃类、醇类、醛类和酯类，主要化合物(相对面积>1%)有14 种，占总峰面积92.56%.柠檬挥发油鉴定出36 个化合物，成分主要为烯烃类、醇类、醛类和酯类，主要化合物(相对面积>1%)有14 种，占总峰面积93.58%.椪柑挥发油鉴定出27 个化合物，成分主要为烯烃类、醛类和醇类，主要化合物(相对面积>1%)有7 种，占总峰面积94.81%.

表1 4 种挥发油的化学成分及相对面积

续表1

续表1

注：-表示没有检测到.

2.3 4 种挥发油中挥发成分的比较

4 种挥发油的主要化学成分都是烯烃类，如d-柠檬烯、r-松油烯、蒎烯、月桂烯、a-萜品烯等，但含量有所不同，在佛手、香橼、柠檬和椪柑挥发油中分别占87.29%，70.42%，79.24%和92.09%.佛手挥发油中鉴定出的主要成分是d-柠檬烯(53.70%)、r-松油烯(17.94%)和左旋-β-蒎烯(4.22%)，这一结果与金晓玲等[1]和赵磊等[18]研究中d-柠檬烯和r-松油烯是佛手挥发油主要成分的结果一致.香橼挥发油的主要成分是d-柠檬烯(31.70%)、r-松油烯(22.09%)和邻伞花烃(11.85%).柠檬挥发油的主要成分是d-柠檬烯(46.06%)、左旋-β-蒎烯(15.16%)、r-松油烯(9.41%).椪柑挥发油的主要成分是d-柠檬烯(73.89%)、r-松油烯(9.12%)、月桂烯(4.12%).因此，佛手和柠檬挥发油的主要成分都相同，含量不同；佛手和香橼、椪柑挥发油中含量最高的2种成分都是d-柠檬烯和r-松油烯，含量有所不同.

4种挥发油中的共同成分有11种(至少一种挥发油的相对面积>1%)，分别为(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、乙缩醛、3-崖柏烯、蒎烯、左旋-β-蒎烯、月桂烯、d-柠檬烯、(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯、r-松油烯、2-蒈烯、α-松油醇，分别占佛手、香橼、柠檬和椪柑挥发油总峰面积的92.24%，76.45%，83.26%和96.33%.挥发油共有成分的相对含量见图5.由图5可知，(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、乙缩醛和蒎烯这3 种化合物含量相差不多，而其余成分的含量差异较大，其中d-柠檬烯、r-松油烯和左旋-β-蒎烯这3 种化合物的含量相差最大且相对含量均较高.

佛手挥发油与香橼挥发油相比，有14 种独特成分被检测出，占总含量1.78%，如4-萜烯醇(0.53%)、柠檬醛(0.18%)、1-异亚丙基-4-亚甲基-7-甲基-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氢萘(0.34%)等.佛手挥发油与柠檬挥发油相比，有15 种独特成分被检测出，占总含量1.76%，如香茅醛(0.12%)、4-萜烯醇(0.53%)和柠檬醛(0.18%)等.佛手挥发油与椪柑挥发油相比，有23 种独特成分被检测出，占总含量6.65%，如(3E)-罗勒烯(2.25%)、1-石竹烯(0.61%)、α-柏木烯(0.68%)和β-甜没药烯(0.98%)等.另外，佛手挥发油特有13 种成分，如4-萜烯醇、紫苏醇、香茅醇、柠檬醛和香芹酚等，在香橼、柠檬和椪柑挥发油中均未被检测出来.

图5 4 种挥发油中共同含有的挥发性成分

2.4 抑菌活性测定

4 种挥发油(10 mg/mL)对黑曲霉和青霉的抑制作用，结果见表 2.表2显示，佛手、香橼和柠檬挥发油对黑曲霉和青霉都有明显的抑制生长作用，而椪柑挥发油对2种真菌有促进生长的作用.佛手和香橼挥发油对黑曲霉都有较强的抑制能力，且强于柠檬挥发油(P<0.05).而对青霉的抑制效果，香橼和柠檬挥发油的抑制效果极显著地高于佛手挥发油(P<0.01).因此,对同一种供试真菌，上述4 种精油的抑菌效果皆不同，可能是由于不同种挥发油具有不同的化学成分，才导致其抑菌活性不同.

表2 4 种挥发油对黑曲霉和青霉的抑制率 %

挥发油种类黑曲霉青霉佛手挥发油59.57±4.67a36.97±1.41b香橼挥发油61.86±1.66a65.53±1.22a柠檬挥发油49.20±2.78b64.47±2.72a椪柑挥发油-29.98±5.91c-13.78±1.85c

注：对于同种菌指标，同列中标注不同角标者具有显著性差异(P<0.05).

2.5 清除DPPH·能力测定

4 种挥发油(20 mg/mL)及对照维生素E(20 mg/mL)的DPPH·清除能力结果见表3.表3显示，佛手挥发油的DPPH·清除率显著高于其他挥发油，说明佛手油有较强的DPPH·清除活性.香橼挥发油与维生素E的DPPH·清除率不存在显著差异。因此，香橼挥发油也有较好的DPPH·清除能力.但相同浓度下，柠檬和椪柑挥发油对DPPH·清除活性显著低于佛手和香橼挥发油，表明这2种挥发油的DPPH·清除能力较弱.

表3 4 种挥发油对DPPH·的清除率 %

挥发油种类DPPH·清除率佛手挥发油77.50±0.22a香橼挥发油62.84±0.31b柠檬挥发油5.34±0.06d椪柑挥发油14.57±0.00c维生素E61.51±0.03b

注：同列中标注不同角标者具有显著性差异(P<0.05).

3 结 论

本试验采用水蒸气蒸馏法提取佛手、香橼、柠檬和椪柑果皮挥发油，对其成分进行了GC-MS分析，并研究了其抑菌和抗氧化活性.结果鉴定出佛手、香橼、柠檬和椪柑挥发油中的成分有烯烃类、醇类、醛类和酯类，主要化合物(相对面积>1%)分别为11，14，14和7 种，四者的相同成分有11 种(至少一种挥发油的相对面积>1%)，其中d-柠檬烯和r-松油烯既是4 种挥发油的主要成分也是共同成分.另外，佛手挥发油分别与香橼、柠檬和椪柑挥发油相比，均含有一些独特的成分，有13 种独特成分在其余3种挥发油中均未被检测出，且各成分的百分含量较少.已有研究表明,柑橘挥发油的主要成分对香气的贡献较小，而精油中占比例较小的醇类、醛类、酮类及酯类等含氧化合物是挥发油香味的主要来源[19].因此，推测佛手挥发油中这13 种独特成分可能是佛手挥发油独特香味的主要来源，这些独特的挥发性成分可以作为鉴定及区分柑橘属挥发油的辅助手段.

4 种挥发油的生物活性结果表明，佛手挥发油和香橼挥发油对黑曲霉有较强的抑制活性；佛手挥发油对青霉有一定的抑制活性，但显著弱于香橼和柠檬挥发油；而椪柑挥发油对两种菌都无抑制作用.另外，佛手挥发油还有显著较强的清除DPPH·能力，其次是香橼、椪柑和柠檬挥发油.因此,佛手、香橼和柠檬挥发油具有相似的抑菌和清除DPPH·的能力，尤其佛手和香橼挥发油的作用都相对较强，这无疑可以促进佛手挥发油在食品保鲜剂、抑霉抗菌剂等方面的应用.在实际应用中还可以利用廉价的椪柑、香橼、柠檬等柑橘属挥发油，添加佛手挥发油的独特挥发性成分合成佛手挥发油，促进佛手加工产业的发展，延长佛手产业链.

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