金魁猕猴桃RT-qPCR内参基因的筛选

张计育，黄胜男，王 涛，潘德林，翟 敏，郭忠仁

（江苏省中国科学院植物研究所，南京210014）

实时荧光定量PCR（Reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR）技术是对PCR反应中每一个循环的产物进行定量分析，具有特异性强、灵敏度高、定量准确、速度快等优点，已成为研究基因功能的重要方法之一。选择较为稳定的内参基因是利用RT-qPCR方法进行基因表达分析的基础。目前，常用的内参基因有肌动蛋白基因（Actin，ACT）、18S rRNA基因、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因、微管蛋白基因（Tubulin）等。RT-qPCR反应中所需的内参基因在各种类型的组织、细胞和各种试验因素条件下均需恒定表达。近年来，关于RT-qPCR试验内参基因的选择已经在许多物种中进行了研究，包括葡萄［1］、甘蔗［2］、白杨［3］、香蕉［4］、荔枝［5］、柑橘［6］、木瓜［7］、苹果［8］、桃［9］等，发现没有一个内参基因在任何组织、任何试验条件下绝对稳定的表达。目前，关于猕猴桃组织特异性表达中内参基因选择的研究还未见报道。本试验以猕猴桃（Actinidia deliciosa）优良品种‘金魁’为材料，研究 6个常用的内参基因在不同组织中的表达特性，并利用 geNorm［10］、NormFinder［11］、BestKeeper［12］3种软件分别评价6个候选内参基因的稳定性，以期为研究猕猴桃各组织中基因表达分析选择稳定的内参基因。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为‘金魁’猕猴桃5年生扦插苗，2016年4—5月取其根、茎、叶、花瓣、花萼、雌蕊、子房、幼果（花后10 d），于液氮中速冻保存用于后续RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA的合成

RNA的提取采用改良的CTAB法［13］。RNA的完整性用2%的琼脂糖凝胶溴化乙锭染色检测。RNA浓度和纯度通过在NanDropND-2000分光光度计上测230 nm、260 nm、280 nm的值确定。cDNA合成采用能消除残留DNA的试剂盒PrimeScript RT reagent kitwith gDNA Eraser（TaKaRa，Japan）进行，每个RNA样品取1μg，具体方法参考说明书。

1.2.2 引物设计和RT-qPCR分析

选取6个内参基因进行RT-qPCR试验以检测其稳定性，包括最常用的ACT基因、亲环蛋白基因（Cyclophilin，CYP）、RNA聚合酶亚基2基因（RNA polymerase subunit2，RP2）、GAPDH基因、β-微管蛋白基因（β-tubulin，TUB）、α-微管蛋白基因（α-tubulin，TUA）。其中 ACT基因的引物参照 Zhang等的报道［14］，其余5个内参基因的序列来源于猕猴桃基因组数据库（http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi），引物设计采用Beacon Designer软件进行，引物序列如表1。采用RT-qPCR方法确定内参基因的表达水平，应用Applied BiosystemsTM7300 Real Time PCR System，20μL反应体积中包含1.5μL 10倍稀释后的cDNA，0.3μL（10 pmol/L）上、下游引物，10μL SYBR荧光染料（TaKaRa code：DRR041A）和7.9μL无菌ddH2O。PCR反应条件：94℃4 min；94℃30 s，60℃20 s，72℃43 s，40个循环。最后一个循环之后，利用热熔解曲线（55—95℃）监控每个PCR扩增的特异性。利用7300系统软件和2－ΔCt方法分析候选基因的表达水平。

表1 猕猴桃6个内参基因的引物序列Table1 Primer sequences of the 6 reference genes in kiwifruit

1.2.3 数据分析

参照公式Q＝2ΔCt，根据每个扩增样品的Ct值计算各基因的相对表达量Q。△Ct＝Ct x－Ct样品（Ct x为所有样品中最低的 Ct值，Ct样品为每个样品的 Ct值）。利用 geNorm［10］、NormFinder［11］、BestKeeper［12］3种软件分别评价6个候选基因在猕猴桃不同组织中表达的稳定性，比较稳定值大小以确定适宜的内参基因。

图1 猕猴桃不同组织总RNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测Fig.1 Agarose gel analysis of total RNA extracted from different tissues of kiw ifruit p lant

2 结果与分析

2.1 RNA质量分析

利用CTAB法从猕猴桃不同组织中提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明：猕猴桃所有样品电泳图谱28S rRNA和 18S rRNA条带清晰（图 1），无弥散带，且28S rRNA亮于18S rRNA，说明在提取过程中几乎没有RNA降解现象。核酸定量检测结果表明：在所有的RNA样品中，其A260/A280比值介于1.90—2.15（表2），表明所提取的RNA较少有蛋白质等的污染。同时，A260/A230的比值均大于2.0（表2），说明RNA纯度较高，没有糖类、盐类和有机物质等的污染。猕猴桃不同组织中总RNA的产量依材料不同存在较大的差别（表2），其中子房中的RNA含量最高，为1 105.7 ng/μL，花瓣中的含量最低，为398.79 ng/μL。以上结果表明，提取的RNA符合后续分子生物学试验的要求。

表2 猕猴桃不同组织总RNA提取质量的比较Table 2 Comparison of the quality of total RNA extracted from different kiwifruit tissues

2.2 引物质量检测

为了确定所设计内参基因引物扩增的单一性，以猕猴桃叶片的第一链cDNA为模板，进行RT-PCR分析。结果表明：6个内参基因引物扩增的熔解曲线均只有明显的单一峰（图3），说明所用引物都能特异性地扩增各内参基因的相应产物，不存在引物二聚体，RT-qPCR的结果准确可靠。

图2 猕猴桃内参基因RT-qPCR扩增产物熔解曲线分析Fig.2 Melting curve analysis of RT-qPCR amplications product of kiwifruit reference genes

2.3 内参基因在不同组织中表达特性分析

利用比较Ct法分析内参基因在猕猴桃不同组织中的表达特性（图3），结果表明：ACT和TUA基因在各组织中的表达量差异较小，表达相对稳定。GAPDH、RP2、CYP、TUB基因在猕猴桃各组织中的表达量差异较大。GAPDH基因在根中的表达量最高，在花瓣中的表达量最低。RP2在叶中的表达量最高，其次是子房，在花萼中的表达量最低。CYP基因在根中的表达量最高，在茎中的表达量最低。TUB在茎中的表达量最高，其次是雌蕊，在花萼中的表达量最低。

2.4 内参基因稳定性分析

利用geNorm软件计算出所有基因与其他候选基因所得配对变异值的平均值M，M值越小，表明所选的内参基因越稳定。结果表明：CYP、TUB、RP2、GAPDH、TUA、ACT基因的 M值依次为 1.577、1.317、1.121、0.804、0.340和0.340，即表达稳定性由高到低为ACT＝TUA＞GAPDH＞RP2＞TUB＞CYP（表3）。根据NormFinder软件分析可得（表3），ACT基因在猕猴桃不同组织中表达最为稳定，为最适内参基因，其次是TUA基因，CYP基因表达稳定性最差。BestKeeper软件的分析结果与NormFinder软件分析结果相同（表3）。可以得出，ACT基因是猕猴桃不同组织中表达最为稳定的内参基因。

图3 猕猴桃内参基因在各组织中的表达特性分析Fig.3 Expression analysis of reference genes in different tissues of kiw ifruit p lant

表3 利用geNorm，Norm Finder和BestKeeper软件计算的不同内参基因表达稳定性的顺序Table 3 Ranking of candidate reference genes in order of their expression stability calculated by geNorm，Norm Finder and BestKeeper

3 讨论

RT-qPCR是有效、快速、可靠的检测基因表达的方法之一，在探索基因功能方面起到了重要的作用。通常情况下，在不同物种、不同品种、不同组织以及不同的试验条件，选择的内参基因是不同的。为了得到更加准确的基因表达结果，在进行基因表达研究之前，必须对内参基因进行稳定性评估，从而选择更加稳定合适的内参基因。Yeap等［15］在5个不同的试验设计下对油棕中14个内参基因进行了稳定性评估，结果表明：油棕生殖器官中表达稳定的内参基因是赤霉素响应蛋白2基因（Gibberellin-responsive protein 2，GRAS）和钙调蛋白基因（Glutaredoxin）；果皮不同发育阶段表达稳定的内参基因是GRAS和亲环蛋白基因（Cyclophilin 2，Cyp2）；营养器官和油棕其他器官中表达稳定的内参基因是Cyp2、GRAS和信使RNA前体剪切因子SLU7（Pre-mRNA splicing factor SLU7，SLU7）；油棕所有组织中最稳定的内参基因是GRAS。Upadhyay等［16］对葡萄中10个内参基因进行了稳定性研究，发现在叶轴伸长过程中，tubulin、EF1α和UBC基因稳定表达，在花和浆果发育阶段，PP2A、SAND、Sutra基因表达稳定。Tong等［9］利用相关软件对11个内参基因在‘雨花1号’和‘京玉’桃不同cDNA样品中表达的稳定性进行了比较分析，发现内参基因TEF2、UBQ10和RP II在所有的供试样品中表达稳定，可以用于总样品组合中桃果实果胶物质降解相关基因的表达分析。Kim等［19］对李子中20个候选内参基因在141个样品中的表达进行了稳定性评估，发现SAND蛋白相关交换蛋白基因（SAND protein related trafficking protein，MON）、延长因子 1α基因（Elongation factor 1 alpha，EF1α）、起始因子5A（Initiation factor 5A，IF5A）是所有样品中表达较为稳定的内参基因，可以用于基因表达研究。本研究对‘金魁’猕猴桃8个不同组织的6个内参基因的表达稳定性进行了研究，结果表明：ACT基因在不同组织的表达较为稳定，可以作为基因在组织中表达研究的内参基因。

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